子宮內膜癌組織中miR-3188和mTOR表達量與預后的相關性研究

陳曉宇，曾慶維，陳紅林，李桂榮

（1.開灤總醫院林西醫院，河北唐山 063000；2.唐山市婦幼保健院，河北唐山 063000）

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是女性高發的生殖系統惡性腫瘤之一，發病率逐年升高，且發病趨于年輕化[1]。在EC 早期給予手術切除及綜合治療，患者5年生存率較高，但對于進展期或復發轉移的患者而言，預后較差，是導致死亡的主要原因[2]。因此，探究EC 復發轉移的指標有著重要意義。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）已被證實參與了EC 的發病和進展過程[3-5]。微小核糖核酸-3188（microRNA-3188，miR-3188）可靶向mTOR 參與鼻咽癌[6]、非小細胞肺癌[7]的細胞增殖及化療耐藥等過程，基于此，有理由推測miR-3188 靶向mTOR 參與了EC 的發病和進展過程，或可用于EC 預后評估。目前，鮮有研究分析其與EC 的關系，本研究主要分析miR-3188和mTOR在EC組織中的表達及與預后的關系，以期為EC 預后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象 前瞻性選取2016年1月～2018年4月在開灤總醫院林西醫院接受手術治療的EC 患者121 例作為研究對象，年齡42～69（55.85±5.95）歲，其中內膜樣癌99 例，漿液性癌15 例，黏液性癌3 例，透明細胞癌4 例；低分化32 例，中分化44 例，高分化45 例；浸潤深度≤1/2 肌層51 例，＞1/2 肌層70 例；淋巴結轉移19 例；子宮外轉移21 例；FIGO 分期Ⅰ期74 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期15 例，Ⅳ期9 例；雌激素受體陽性88 例，孕激素受體陽性86 例。納入標準：①經病理活組織檢查證實為EC；②有保存在液氮罐中完好的EC 組織和癌旁組織（距離癌緣5 cm 及以上）；③臨床資料完整，均完成隨訪。排除標準：①切除EC組織前接受過放、化療；②伴心肝腎等實質臟器功能嚴重異常；③其他惡性腫瘤或自身免疫性疾病。本研究受試者均簽署了知情同意書，符合《赫爾辛基宣言》，經開灤總醫院林西醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 752 型紫外分光光度計（上海光學儀器五廠有限公司），CFX96 型實時熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司），TRIzol 試劑和逆轉錄試劑盒（德國羅氏公司），miR-3188 和內參U6 引物（上海吉瑪制藥技術有限公司），兔抗人mTOR 單克隆抗體和山羊抗兔二抗（臺灣亞諾法生技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 miR-3188 表達量檢測：用實時熒光定量PCR法[8]檢測組織中miR-3188 表達量。步驟如下：①取組織，剪碎，用TRIzol 試劑提取總RNA；②用紫外分光光度計檢測RNA 純度，吸光度值比（A260nm/280nm）在1.9～2.0；③用逆轉錄試劑盒將RNA 逆轉錄成cDNA；④用實時熒光定量PCR 儀擴增cDNA，擴增條件為95 ℃ 5 min，40 個循環，95℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。miR-3188上游序列：5’-AGAGGCUUUGUGCGGAUACGGGG-3’，下游序列 ：5’-UCUCCGAAACACGCCUAUGCCCC-3’；內參U6上游序列：5’-GCTTCGGCAGCACATATAC TAA-3’，下游序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCG T-3’。用2-ΔΔCt計算miR-3188 表達量。

1.3.2 mTOR 表達量檢測：用蛋白質免疫印跡法[9]檢測組織中mTOR 表達量。①取實驗1.3.1 中剪碎的組織，用RIPA 裂解液裂解組織細胞，4℃ 4 000 r/min 離心15 min，提取上清液，BCA 法蛋白定量；②用10g/dl SDS-PAGE 凝膠電泳80V 15 min，加壓120V 至溴酚藍跑出膠面，300 mA 60 min 轉膜，5 g/dl 脫脂牛奶搖床孵育1 h；③滴加兔抗人mTOR單克隆抗體，4℃下孵育過夜；滴加山羊抗兔二抗，搖床孵育1 h；④ECL 發光液顯影。用Image J 1.8.0軟件讀取凝膠圖像。

1.3.3 隨訪：用門診復診方式進行隨訪，每3 ～6個月隨訪1 次，了解EC 復發轉移及死亡等情況。本研究隨訪終點為發生EC 復發轉移及因復發轉移死亡或至末次隨訪結束（末次隨訪時間為2021年4月22日），中位隨訪時間為36（10～36）個月。

1.4 統計學分析 用SPSS 25.0軟件進行統計分析。正態分布的計量資料用均數±標準差（±s）表示，組內比較用配對樣本t檢驗，兩組間比較用獨立樣本t檢驗；多組間比較用F檢驗，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。計數資料用n（%）表示，組間比較用χ2檢驗。用COX 回歸分析EC 預后的風險因素。用Pearson 相關分析miR-3188 與mTOR 的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-3188 和mTOR 在EC組織和癌旁組織中的表達 EC 組織中miR-3188 相對表達量低于癌旁組織（0.60±0.14 vs 1.46±0.14），EC 組織中mTOR 相對表達量高于癌旁組織（0.92±0.11 vs 0.63±0.11），差異均有統計學意義（t=48.995，19.348，均P=0.000）。

2.2 miR-3188 和mTOR 與EC 臨床病理參數的關系 見表1。不同年齡、是否絕經、不同病理類型、是否雌激素受體陽性及是否孕激素受體陽性的miR-3188 和mTOR 相對表達量比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。不同浸潤深度、是否淋巴結轉移、是否子宮外轉移、不同分化程度及不同FIGO 分期的miR-3188 和mTOR 相對表達量比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

表1 不同臨床病理參數miR-3188 和mTOR 相對表達量比較（±s）

表1 不同臨床病理參數miR-3188 和mTOR 相對表達量比較（±s）

項 目 n miR-3188 相對表達量 t/F P mTOR 相對表達量 t/F P年齡（歲） ≤60 54 0.61±0.13 0.472 0.638 0.91±0.11 0.723 0.471 ＞60 67 0.60±0.14 0.92±0.10 絕經 否 35 0.61±0.13 0.668 0.505 0.89±0.11 1.976 0.050 是 86 0.60±0.14 0.93±0.10病理分型 內膜樣癌 99 0.60±0.14 0.330 0.803 0.92±0.11 0.882 0.453 漿液性癌 15 0.61±0.13 0.90±0.09 黏液性癌 3 0.52±0.13 0.84±0.17 透明細胞癌 4 0.60±0.18 0.90±0.10浸潤深度 ≤1/2 肌層 51 0.65±0.12 3.705 0.000 0.88±0.11 3.707 0.000 ＞1/2 肌層 70 0.56±0.14 0.95±0.10淋巴結轉移 否 102 0.63±0.13 8.611 0.000 0.90±0.10 6.677 0.000 是 19 0.44±0.08 1.01±0.06子宮外轉移 否 100 0.63±0.13 6.429 0.000 0.90±0.10 6.420 0.000 是 21 0.45±0.08 1.01±0.07雌激素受體 陽性 88 0.61±0.14 0.618 0.538 0.92±0.11 1.114 0.268 陰性 33 0.59±0.12 0.90±0.09孕激素受體 陽性 86 0.59±0.15 1.064 0.290 0.93±0.10 1.937 0.055 陰性 35 0.62±0.11 0.89±0.11分化程度 低分化 45 0.56±0.13 2.440 0.016 0.95±0.12 2.400 0.018 中、高分化 76 0.62±0.14 0.90±0.10 FIGO 分期 Ⅰ+Ⅱ 97 0.64±0.12 6.898 0.000 0.89±0.10 7.017 0.000 Ⅲ+Ⅳ 24 0.45±0.08 1.01±0.07

2.3 未復發組和復發組的miR-3188 和mTOR 相對表達量比較 未復發組的miR-3188 相對表達量高于復發組（0.66±0.11 vs 0.45±0.08），mTOR 相對表達量低于復發組（0.88±0.10 vs 1.02±0.06），差異均有統計學意義（t=11.220，9.229，均P=0.000）。

2.4 EC 預后的風險因素分析 見表2、表3。將EC 預后作為因變量，將年齡、絕經、病理類型、分化程度、FIGO 分期、雌激素受體、孕激素受體、miR-3188 和mTOR 作為自變量，分別納入COX回歸分析，結果顯示分化程度、FIGO 分期、miR-3188 和mTOR 與EC 預后有關（均P＜0.05）。將EC 預后作為因變量，將分化程度、FIGO 分期、miR-3188 和mTOR 作為自變量，一并納入COX回歸分析，結果顯示分化程度高、miR-3188 表達量高是EC 預后的獨立保護因素（均P＜0.05），FIGO 分期高、mTOR 表達量高是EC 預后的獨立危險因素（均P＜0.05）。

表2 賦值情況

表3 EC 預后風險因素的COX 回歸分析

2.5 miR-3188 與mTOR 的關系 見圖1。Pearson相關分析結果顯示EC 組織中miR-3188 相對表達量與mTOR 相對表達量呈負相關關系（r=-0.409，P=0.000）。

圖1 miR-3188 與mTOR 的散點圖

3 討論

目前，關于EC 發病的病理生理機制仍未完全闡明，高發病率、高復發率仍是其主要特征[10-11]。探究預示EC 預后的指標有著重要意義。目前，已有報道[12]證實miR-3188 與EC 細胞對沙利霉素的敏感性有關，其或可用于EC 預后評估。既往關于mTOR 與EC 的研究主要著重于其調節EC 進展的機制及在EC 組織中的表達情況，但關于其表達量對預后的預示作用鮮有研究。本研究主要從分子生物學角度分析與EC 有關的生物標志物miR-3188 和mTOR 與預后的關系，以期為EC 預后評估提供參考。

本研究結果顯示EC 組織中miR-3188 相對表達量低于癌旁組織，EC 組織中mTOR 相對表達量高于癌旁組織，上述結果提示miR-3188 和mTOR參與了EC 的發病和進展過程，是EC 預后評估的潛在生物標志物。進一步分析二者與EC 臨床病理參數的關系，結果顯示不同浸潤深度、是否淋巴結轉移、是否子宮外轉移、不同分化程度及不同FIGO 分期的miR-3188 和mTOR 相對表達量差異均有統計學意義（P<0.05），該結果提示miR-3188和mTOR 與EC 進展有關，可能通過參與EC 肌層浸潤、淋巴結轉移、子宮外轉移及腫瘤分化影響預后。本研究比較了EC 未復發組和復發組的miR-3188 和mTOR 相對表達量，結果顯示未復發組的miR-3188 相對表達量高于復發組，mTOR 相對表達量低于復發組，該結果進一步證實miR-3188 和mTOR 與EC 預后有關，或可輔助用于臨床醫師對EC 治療及預后管理做出有效決策。

既往研究[6-7,13-14]顯示miR-3188參與了鼻咽癌、非小細胞肺癌、乳腺癌及肝細胞肝癌進展，且在鼻咽癌和非小細胞肺癌中已被證實可調控mTOR 參與腫瘤進展。本研究中COX 回歸分析結果顯示miR-3188 表達量高是EC 預后的獨立保護因素，mTOR表達量高是EC 預后的獨立危險因素，推測其原因是mTOR 在EC 組織中表達上調，其通過調節EC細胞增殖、侵襲和轉移等影響預后[15-17]；而miR-3188 在EC 進展過程中通過靶向mTOR 抑制EC 細胞增殖、侵襲和轉移，EC 組織中miR-3188 表達量可反映其對mTOR 的抑制程度，進而反映EC 預后。Pearson 相關分析結果顯示EC 組織中miR-3188 相對表達量與mTOR 相對表達量呈負相關，該結果進一步證實了miR-3188 可能靶向mTOR 參與了EC發病和進展過程。此外，本研究中COX 回歸分析結果還顯示分化程度高是EC 預后的獨立保護因素，FIGO 分期高是EC 預后的獨立危險因素，該結果與既往研究[18-20]結果一致。

本研究尚存在一定不足，一是隨訪時間偏短，僅分析了miR-3188 和mTOR 與EC 近期預后的關系，關于二者與EC 遠期預后的關系未能進行分析；二是未開展基礎研究證實miR-3188 是否靶向mTOR 影響EC 預后；三是關于血液中的miR-3188 和mTOR與EC 預后的關系未進行分析，下一步將針對上述不足進行補充，以期為EC 預后評估添磚加瓦。

綜上所述，EC 組織中miR-3188 表達量低、mTOR 表達量高與預后不良有關。