結直腸癌組織中硫氧還蛋白-1與硫氧還蛋白互作蛋白的表達及其臨床意義

楊婕琳，陳文婷，胡曉利（河北北方學院附屬第一醫院.消化內科 ; 內鏡中心, 河北張家口 075000）

結直腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤，在疾病早期通常無明顯的臨床癥狀，即使到了中期也僅會出現血便、腹痛、排便習慣改變等缺乏特異度的癥狀，因此疾病的早期確診率低，患者的預后普遍較差[1]。結直腸癌的發病機制復雜，可能與遺傳、飲食、肥胖等多種因素有關，目前結直腸癌的具體發病機制仍未完全闡明，因此研究與結直腸癌發病相關的分子機制具有重要的意義[2]。硫氧還蛋白-1（thioredoxin-1, TRX-1）以及硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP） 均是硫氧還蛋白系統的重要組成部分，具有調節機體氧化應激的作用[3]，近年來的研究發現[4-6]，TRX-1 和TXNIP 與非小細胞肺癌、胃癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤密切相關，二者在惡性腫瘤的發生發展中有著促癌因子與抑癌因子的作用。炎癥性腸病是結直腸癌的重要危險因素，相關研究發現[7]，TRX-1 在潰瘍性結腸炎患者的腸隱窩上皮細胞中表達增加，且可促進疾病的進展。然而目前少有關于TRX-1 和TXNIP 與結直腸癌的報道，二者在結直腸癌中發揮著何種作用尚不明確。本研究旨在探討TRX-1 和TXNIP 在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義，為研究硫氧還蛋白系統在結直腸癌的發生、發展中的作用，現將研究報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月～12月河北北方學院附屬第一醫院收治的結直腸癌患者72 例，年齡45 ～70 歲，平均年齡59.84±7.52 歲，男性44例，女性28 例；TNM 分期：I～II 期48 例，III～IV期24 例；淋巴結轉移30 例，無淋巴結轉移42 例；腫瘤大小：<5cm 44 例，≥5cm 28 例；分化程度：中高分化52 例，低分化20 例。納入標準：①所有患者均經臨床病理確診為結直腸癌；②未并發其他惡性腫瘤；③入組前未接受任何形式的抗腫瘤治療；④患者及其家屬對本次研究內容均知情，并自愿參與本次研究。排除標準：①并發有嚴重感染者；②心、肝、腎等重要臟器功能障礙者；③臨床資料不全者；④結直腸癌復發者。另選同時期在我院接受治療的結直腸息肉患者40 例作為對照組，年齡43～68 歲，平均年齡58.52±6.51 歲，男性26 例，女性14 例。本研究通過了我院倫理委員會的批準。

1.2 儀器與試劑 SP 免疫組化試劑盒，DAB 試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；TRX-1 一抗、TXNIP一抗（美國Zymed公司）；LECIA石蠟切片機，德國LECIA公司；光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 方法 收集結直腸癌患者以及結直腸息肉患者手術切除的病理標本，采用免疫組化法進行檢測，常規石蠟包埋切片，分別采用二甲苯和梯度酒精進行脫蠟、水化處理。采用3ml/dl H2O2除去內源性的過氧化氫酶活性后常規進行抗原修復。山羊血清封閉后加入稀釋好的一抗（TRX-1 為1:200，TXNIP 為1:400），4℃過夜。滴加生物素標記的二抗，37℃溫箱孵育30min。采用DAB 試劑進行顯色，蘇木精復染。分別采用梯度酒精和二甲苯進行脫水、透明處理，中性樹膠封片。

顯微鏡高倍視野下隨機選取的5 個不相重疊區域進行觀察，TRX-1 和TXNIP 的陽性染色均是細胞質中出現黃色顆粒。染色強度評分標準如下：無著色0 分，淡黃色1 分，黃色2 分，棕褐色3分。陽性染色細胞數比例評分標準如下：低于5% 0 分，6%～25% 之間1 分，26%～50% 之間2 分，51%～75%之間3 分，75%以上4 分。最終得分為染色強度得分與陽性染色細胞數比例得分之和，若最終得分為0 ～1 分則判定為陰性表達，最終得分為2 ～7 分則判定為陽性表達[8-9]。

1.4 統計學分析 采用SPSS23.0 對數據進行統計學分析。計量數據均通過正態性檢驗，以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗。計數資料采用率的形式描述，采用卡方檢驗。相關分析為spearman相關檢驗。采用接受者工作特征曲線（receiver operation characteristic，ROC）分析TRX-1 和TXNIP對結直腸癌的診斷價值。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 結直腸癌組織和結直腸息肉組織中TRX-1，TXNIP 的表達情況 結直腸癌組織中TRX-1的陽性表達率高于結直腸息肉組織（66.67% vs 25.00%），TXNIP 的陽性表達率低于結直腸息肉組織(30.56% vs 77.50%)，差異有統計學意義（χ2=17.880, 22.733，均P<0.05）。

2.2 結直腸癌組織中TRX-1，TXNIP 的表達和臨床病理特征的關系 見表1。結直腸癌組織中TRX-1 的表達與年齡、性別無關（P>0.05），與TNM 分期、淋巴結轉移、腫瘤大小以及分化程度有關（P<0.05）；結直腸癌組織中TXNIP 的表達與年齡、性別、腫瘤大小、分化程度無關（P>0.05），與TNM 分期、淋巴結轉移有關（P<0.05），差異均有統計學意義。

表1 結直腸癌組織中TRX-1 和TXNIP 的表達和臨床病理特征的關系

2.3 結直腸癌組織中TRX-1 和TXNIP 表達的相關性 經spearman 相關分析顯示，結直腸癌組織中TRX-1 和TXNIP 的表達呈負相關（r=-0.298，P<0.05）。

2.4 TRX-1，TXNIP 對結直腸癌的診斷價值 見表2，圖1。以病理診斷結果為金標準，以結直腸癌組織中的相關數據為陽性樣本，以結直腸息肉組織中的相關數據為陰性樣本，采用ROC 曲線分析TRX-1 和TXNIP 對結直腸癌的診斷價值。結果顯示，TRX-1 和TXNIP 對結直腸癌均有一定的診斷價值，曲線下面積分別為0.708 和0.735。聯合診斷時存在TRX-1 表達陽性或TXNIP 表達陰性即判定為結直腸癌診斷陽性，TRX-1 表達陰性且TXNIP 表達陽性則判定為結直腸癌診斷陰性。結果顯示，二者聯合可進一步提高診斷價值，曲線下面積為0.792，且敏感度有了大幅度的提升。

表2 TRX-1，TXNIP 對結直腸癌的診斷價值

圖1 TRX-1，TXNIP 診斷結直腸癌的ROC 曲線圖

3 討論

結直腸癌具有較高的發病率，在世界范圍內結直腸癌的發病率排在男性惡性腫瘤中的第三位，女性惡性腫瘤中的第二位[10]。由于發病早期缺乏特異性癥狀，大部分患者確診時已處于中晚期，現有的化學療法和分子靶向療法等治療效果欠佳，患者預后普遍較差[11]。癌胚抗原、糖類抗原199 等腫瘤標志物雖可在早期輔助診斷結直腸癌，但還是存在部分的誤診和漏診的情況[12]。另一方面，惡性腫瘤的靶向治療在近年來取得了較大的進展，但現有的靶點依然存在較多局限性。研究與結直腸癌發生、發展密切相關的蛋白，對尋找新的腫瘤標志物以及治療靶點均有重要意義。

TRX-1 是硫氧還蛋白家族的成員之一，由104 個氨基酸組成，分子量12 kD，其是機體氧化還原調控的重要蛋白質，可起到抗氧化作用。近年來的研究發現，TRX-1 在多種惡性腫瘤中異常高表達，發揮著促癌的作用，如楊薈敏等[13]人的研究發現，TRX-1 在肝癌患者腫瘤組織中的表達高于癌旁組織，且過表達TRX-1 可減弱脂連蛋白對小鼠移植性肝癌生長的抑制作用；潘濤等[14]人的研究顯示，TRX-1 高表達與胃癌患者預后不良有關。本研究結果顯示，結直腸癌組織中TRX-1 的陽性表達率高于結直腸息肉組織，且高TNM 分期、有淋巴結轉移、腫瘤大小≥5cm、分化程度低的結直腸癌組織中TRX-1 的陽性表達率明顯增高，這提示TRX-1 可促進結直腸癌的惡性進展。相關研究發現[15]，TRX-1可促進上皮到間質細胞的轉化，進而促進結直腸癌的遷移和侵襲；細胞實驗發現[16]，抑制TRX-1 的表達可增強丁酸鈉對結直腸癌細胞生長和遷移的抑制作用，而過表達TRX-1 則可減弱丁酸鈉的抗腫瘤作用；WANG 等[17]人的研究也顯示，TRX-1 抑制劑可有效抑制結直腸癌細胞的生長、遷移和侵襲。由此可見，TRX-1 在結直腸癌中也是發揮著促癌作用，抑制其表達可能是治療結直腸癌的新思路。

TXNIP 是TRX-1 的配體蛋白，TXNIP 第247位半胱氨酸殘基可與TRX-1 的第32 位半胱氨酸殘基形成穩定的二硫鍵[18]，因此，TXNIP 可負向調控TRX-1 的表達，通過相關性分析發現，結直腸癌組織中TRX-1 和TXNIP 的表達呈負相關。結果顯示，結直腸癌組織中TXNIP 的陽性表達率低于結直腸息肉組織，且低TNM 分期、無淋巴結轉移的結直腸癌組織中TXNIP 的陽性表達率較高，這提示TXNIP 可能參與了結直腸癌的發生、發展，發揮著抑癌因子的作用。目前較少研究涉及到TXNIP 調控結直腸癌進展的具體作用機制，負向調控TRX-1可能是其重要的作用機制之一。LIN 等[19]人的研究發現，S100P 可通過負向調控TXNIP 的表達來促進TRX-1 的表達，進而促進結直腸癌的惡性進展。調節機體的抗氧化功能是TXNIP 最主要的生理作用之一，其在與TRX-1 結合后會影響機體的抗氧化性，促進活性氧的生成[20]。相關研究顯示[21]，TXNIP可通過促進活性氧的生成來誘導子宮內膜癌細胞凋亡和細胞周期阻滯，進而發揮抑癌的作用，這可能是其影響腫瘤惡性進展的重要作用機制之一。

此外，本研究通過ROC 分析發現，TRX-1 和TXNIP 對結直腸癌均有一定的診斷價值，曲線下面積分別為0.708（95%CI：0.608～0.809）和0.735（95%CI：0.637～0.832）。然而單一指標診斷通常具有一定的局限性，結合多個相關的生物標志物進行聯合診斷是目前的趨勢。本研究結果顯示TRX-1和TXNIP 二者聯合可進一步提高診斷價值，曲線下面積為0.792（95%CI：0.699～0.885），提示兩者也具有成為臨床輔助診斷結直腸癌生物標志物的潛力。然而本研選取的病例數較少，該結論還有待大型研究進行驗證。另一方面，本研究僅通過組織學中的表達情況分析了TRX-1 和TXNIP 診斷結直腸癌的潛力，然而實際臨床中獲得組織樣本后即可通過病理檢查進行診斷，因此研究組織中的表達對臨床診斷的輔助價值有限，在后續的研究將進一步分析血清TRX-1 和TXNIP 對結直腸癌的輔助診斷價值。

綜上所述，TRX-1 在結直腸癌組織中異常高表達，TXNIP 異常低表達，二者的表達水平均與部分臨床病理參數有關，且對結直腸癌均有一定的診斷價值。TRX-1 和TXNIP 有望成為結直腸癌新的診斷標志物和治療靶點。然而目前TRX-1 和TXNIP與結直腸癌的相關研究較少，尤其是TXNIP，二者在結直腸癌中的具體作用機制還有待更多的基礎研究進行驗證。