肝癌組織中l(wèi)ncRNA-PRR34-AS1的表達特性及其對肝癌細胞增殖、遷移的影響和潛在分子機制

魏 英，王小林

（榆林市第二醫(yī)院a.腫瘤放療科;b.普外科,陜西榆林 719000）

據(jù)《2020年全球癌癥統(tǒng)計》，全球新增約905 677例新診斷肝癌病例和830 180 例肝癌死亡病例，肝癌所致死亡人數(shù)位居世界第三[1-2]。盡管在中國觀察到肝癌的發(fā)病率和死亡率呈顯著下降趨勢，但龐大的人口基礎和快速的人口增長仍然導致大量新的肝癌病例出現(xiàn)并呈上升趨勢[3]。因此，有必要更好地了解肝癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，研發(fā)出有效的靶向治療方法[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因和抑癌基因的失調導致了肝癌的發(fā)生和發(fā)展，其中大多數(shù)集中在蛋白質編碼基因上[5-6]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs ，lncRNAs）被定義為長度大于200 nt 的非編碼RNA，其通過表觀遺傳調控機制發(fā)揮其基因轉錄調控功能[7]。越來越多證據(jù)表明，lncRNAs 與多種病理、生理過程有關，在癌癥中經(jīng)常觀察到lncRNA 的異常表達[8-10]。發(fā)現(xiàn)lncRNAs能夠調節(jié)癌細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等惡性行為及上皮-間質轉化和細胞耐藥性[11-13]。PRR34-AS1 是最新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，目前國內外對其報道有限，但最新研究在肝癌中發(fā)現(xiàn)其高表達，通過調節(jié)mRNA 介導參與了肝癌細胞的各種生物學行為過程，與肝癌發(fā)展關系密切，證明了PRR34-AS1 的原癌基因屬性，為肝癌研究提供了新的生物靶標[14-15]。然而PRR34-AS1 在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制尚未完全明確且有關報道鮮少。因此，本研究擬進一步探究肝癌組織中PRR34-AS1 的表達特性及其對肝癌細胞的作用機制，以期為臨床肝癌的研究攻克提供新的分子機制基礎。

1 材料與方法

1.1 研究對象 人肝癌HepG2 細胞購于中國科學院上海細胞庫，10ml/dl 胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液中加入青霉素100 IU/ml 和鏈霉素100 μg/ml，37 ℃，5ml/dl CO2孵育箱培養(yǎng)。收集2020年6月～12月于榆林市第二醫(yī)院行手術治療的30 例肝癌患者癌組織及其對應癌旁正常組織標本，所有入選病例術前未行放化療治療，組織均由手術獲取，離體后快速行冰凍病理確認為肝細胞癌，后置于低溫液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑及儀器 胎牛血清、鏈霉素、青霉素及RPMI-1640 培養(yǎng)液購自美國HyClone 公司；MTS反應液購自美國Corning 公司；酶標儀購自美國賽默飛公司；lipo2000 購自美國Invitrogen 公司；實時熒光定量PCR 試劑盒、PCR 儀、逆轉錄試劑盒、Trizol 試劑購自美國Promega 公司；酶標儀購自美國Bio Rad 公司；轉染細胞所用的陰性對照siCTL無義序列及2 條干擾siRNA 序列及JAK1 3' UTRwt 野生型和JAK1 3' UTR-mut 突變型熒光質粒均由南京科佰生物科技有限公司設計合成；熒光素酶測定系統(tǒng)購自北京Promega 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞轉染及分組: 取待測細胞培養(yǎng)至生長密度達80%～85%左右時參照Lipo 2000 試劑盒說明書操作進行細胞轉染，置于37℃，5ml/dl CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)48 h。細胞分組：轉染陰性對照siCTL 無義序列的細胞設為siCTL 對照組；轉染2條PRR34-AS1 干擾siRNA 序列細胞設為siRNAPRR34-AS1#1 組和siRNA-PRR34-AS1#2 組；轉染2 條JAK1 干擾siRNA 細胞設為siRNA- JAK1#1組和siRNA- JAK1#2 組；共轉染siRNA-PRR34-AS1+JAK1 細胞設為共轉染組。

1.3.2 實時熒光定量PCR 實驗（RT-qPCR）: 使用primer 3 軟 件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/） 設計特異性qPCR 引物；采用Trizol 試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，以此為模板配置PCR 反應體系，行RT-qPCR 反應。引物序列：PRR34-AS1上游：5’-AGAACGGAGCCGATGTTTCG-3’，下游：5’-TAACGCAGGCGGACGAATCT-3’；JAK1 上 游：5’-AATCTTCTGTATCAGCTCATGCTGACT-3’，下游：5’-CAGTTTTTACGGCTTCAGTTTACTT-3’；內參GAPDH 上游：5’-GAACGCGAAGCTTGTCATC AA-3’，下游：5’CTAAGCAGTTGCTCGTGCAG-3’。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，循環(huán)40 次。反應完成后，拷貝數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct法計算各目的基因相對表達。

1.3.3 MTT 細胞增殖實驗：取轉染培養(yǎng)后對數(shù)生長期待測細胞以1×106/孔接種于96 孔板，每組設3 個生物復孔，37 ℃，5ml/dl CO2條件下孵育4 h，每孔加入100 μl MTS 反應溶液，常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)2，24，48，72 h，在490 nm 處測量各孔吸光度（A值）。

1.3.4 劃痕遷移實驗 : 取培養(yǎng)貼壁后各組進行轉染，到細胞生長至密度達90%時用槍頭垂直于孔板背面在盤中央劃痕，PBS 清洗細胞3 次，去除劃下細胞，加入無血清培基液，37 ℃，5ml/dl CO2培養(yǎng)24 h 后拍照觀察，實驗重復3 次取平均值。

1.3.5 PRR34-AS1 靶基因預測：通過生物信息學數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站預測lncRNA PRR34-AS1 與JAK1 結合的基因位點，雙熒光素酶報告基因實驗驗證兩者靶向關系。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因實驗：將細胞接種到6孔板，通過構建包含PRR34-AS1 基因位點在內的含有海腎熒光素酶報道質粒的JAK1 3’ UTR-wt 野生型和JAK1 3’UTR-mut 突變型熒光質粒，將其轉染至肝癌細胞中，使用熒光素酶測定系統(tǒng)測量各組細胞熒光素酶活性，實驗重復3 次取平均值。

1.3.7 細胞回補實驗：取消化培養(yǎng)后各組細胞鋪于96 孔板或6 孔板，37 ℃，5ml/dl CO2孵育貼壁后進行轉染，將siCTL，siRNA-PRR34-AS1，siRNAJAK1，siRNA-PRR34-AS1+ JAK1 及siRNA-JAK1 + PRR34-AS1 分別轉染至細胞中，每孔設3 個復孔；后按照細胞增殖實驗、細胞劃痕遷移實驗步驟檢測各組細胞增殖、遷移情況進行實驗驗證。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0 進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用one-way ANOVA 分析，組間比較采用LSD 檢驗；癌組織及對應癌旁組織中差異比較采用配對t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織中l(wèi)ncRNA PRR34-AS1 表達特征 30組臨床肝癌組織中PRR34-AS1 表達顯著高于臨近正常組織（5.714±0.612 vs 2.981±0.572），差異有統(tǒng)計學意義（t=17.870，P=0.000）；同時檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，相比于臨近正常組織，肝癌組織中PRR34-AS1 顯著高表達，具有表達水平越高預后越差的臨床特征，見圖1。提示PRR34-AS1 扮演原癌基因角色，可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。

圖1 GEPIA 數(shù)據(jù)庫中分析PRR34-AS1 在肝癌中的表達特征

2.2 敲降PRR34-AS1 表達轉染效率驗證 檢測發(fā)現(xiàn)siRNA-PRR34-AS1#1 組（0.289±0.046） 和siRNAPRR34-AS1#2 組（0.302±0.031）細胞中PRR34-AS1表達明顯低于陰性對照siCTL 組（1.001±0.030），差異有統(tǒng)計學意義（F=375.552，P＜0.001），提示敲降PRR34-AS1 表達轉染效率驗證成功。

2.3 PRR34-AS1 促進肝癌細胞的增殖和遷移 細胞增殖實驗顯示，隨著轉染時間延長，siRNA-PRR34-AS1#1 組和siRNA-PRR34-AS1#2 組細胞增殖率較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），不同時間點各組細胞A值見表1。劃痕遷移實驗顯示，siRNA-PRR34-AS1#1 組（38.451±4.263）和siRNAPRR34-AS1#2 組（42.106±3.512）細胞愈合遷移速率較對照組（83.247±6.205）顯著減慢，差異有統(tǒng)計學意義（F=83.357，P＜0.001），表明PRR34-AS1高表達促進了肝癌細胞的增殖和遷移，發(fā)揮致癌基因作用。

表1 敲低PRR34-AS1 表達對肝癌細胞A 值的影響(±s)

表1 敲低PRR34-AS1 表達對肝癌細胞A 值的影響(±s)

時間（h） siCTL 組① siRNA-PRR34-AS1#1 組② siRNA-PRR34-AS1#2 組③ F P ① vs ② ① vs ③t1 P1 t2 P2 0 0.189±0.012 0.196±0.009 0.193±0.011 0.321 0.737 0.808 ＞0.05 0.426 ＞0.05 24 0. 386±0.021 0.209±0.016 0.221±0.017 89.297 <0.001 11.958 ＜0.001 11.147 ＜0.001 48 0.537±0.027 0.334±0.019 0.347±0.015 88.378 <0.001 11.875 ＜0.001 11.115 ＜0.001 72 0.649±0.032 0.398±0.022 0.420±0.024 83.440 <0.001 11.664 ＜0.001 10.641 ＜0.001

2.4 PRR34-AS1 靶向正調控JAK1 表達，JAK1 促進肝癌細胞增殖 通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，PRR34-AS1可通過調控JAK1 表達參與癌癥的發(fā)展進程[16]。研究經(jīng)檢索生物信息學數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)JAK1 3’ UTR區(qū)含有潛在的PRR34-AS1 結合位點(見圖2)，推測JAK1 可能是PRR34-AS1 的靶基因。后將JAK1 3’ UTR質粒及siRNA-PRR34-AS1共轉染至肝癌細胞中，雙熒光素酶報告基因實驗驗證發(fā)現(xiàn)，轉染siRNA-PRR34-AS1 顯著抑制了JAK1 3’ UTR-wt 質粒熒光素酶活性（P<0.001），而對JAK1 3’ UTRmut 質粒熒光素酶活性無明顯影響（P>0.05），見表2，證實JAK1 是PRR34-AS1 的靶基因。進一步探究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比（1.002±0.003），siRNAPRR34-AS1#1 組（0.453±0.019）和siRNA-PRR34-AS1#2 組（0.476±0.022）細胞中JAK1 相對表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（F=716.287，P＜0.001），表明PRR34-AS1 靶向正調控JAK1 表達。同時經(jīng)轉染2 條siRNA 敲低肝癌細胞中JAK1 表達，發(fā)現(xiàn)較對照組相比，敲低JAK1 表達明顯減緩了肝癌細胞的增殖速率（P<0.05），見表3，證明肝癌發(fā)生發(fā)展過程中JAK1 同樣發(fā)揮促癌基因作用。

圖2 生物信息網(wǎng)站預測PRR34-AS1 與JAK1 的結合位點

表2 PRR34-AS1 與JAK1 結合關系驗證(±s)

表2 PRR34-AS1 與JAK1 結合關系驗證(±s)

類別 siCTL 組 siRNA-PRR34-AS1 組 t P WT 1.002±0.005 0.437±0.021 45.333 ＜0.001 MUT 1.001±0.003 0.977±0.016 1.490 0.211

表3 敲低JAK1 表達對肝癌細胞A 值的影響(±s)

表3 敲低JAK1 表達對肝癌細胞A 值的影響(±s)

時間（h） siCTL 組① siRNA-JAK1#1 組② siRNA-JAK1#2 組③ F P ① vs ② ① vs ③t1 P1 t2 P2 0 0.203±0.008 0.201±0.012 0.202±0.010 0.039 0.962 0.240 ＞0.05 0.315 ＞0.05 24 0. 396±0.022 0.232±0.019a 0.225±0.016a 76.548 <0.001 10.485 ＜0.001 10.932 ＜0.001 48 0.501±0.026 0.354±0.020a 0.332±0.018a 54.272 <0.001 8.334 ＜0.001 9.581 ＜0.001 72 0.598±0.031 0.421±0.025a 0.417±0.023a 45.465 <0.001 8.164 ＜0.001 8.349 ＜0.001

2.5 JAK1 在肝癌組織中的表達及與PRR34-AS1 的相關性分析 30 組臨床肝癌組織中JAK1 表達顯著高于癌旁正常組織（5.963±1.214 vs 4.052±0.876），差異有統(tǒng)計學意義（t=6.992，P=0.000），肝癌組織中PRR34-AS1 與JAK1 表達呈顯著正相關（r=0.907，P<0.05）。

2.6 PRR34-AS1 正向調控JAK1 促進肝癌細胞增殖和遷移 見表4。細胞回補試驗驗證發(fā)現(xiàn)，在敲低PRR34-AS1 表達的肝癌細胞中回補JAK1 后，肝癌細胞增殖、遷移速率又回歸到正常水平。證實PRR34-AS1 可通過調控JAK1 來促進肝癌細胞的增殖和遷移。

表4 PRR34-AS1 調控JAK1 對肝癌細胞增殖、遷移的影響(±s)

表4 PRR34-AS1 調控JAK1 對肝癌細胞增殖、遷移的影響(±s)

注：t1 為① vs ②，t2 為① vs ③，t3 為① vs ④；細胞增殖A 值的t1=10.122，t2=9.252，t3=1.739，均P<0.001;細胞遷移率(%)的t1=8.100，t2=8.545，t3=0.683，均P<0.001。

類別 siCTL 組① siRNA-PRR34-AS1 組② siRNA-JAK1 組③ siRNA-PRR34-AS1+ JAK1 組④ F 值 P 值細胞增殖A 值 0.586±0.019 0.423±0.015a 0.437±0.023a 0.614±0.021 90.701 ＜0.001細胞遷移率(%) 82.154±5.896 48.213±3.988 a 46.347±4.305a 85.014±6.013 50.224 ＜0.001

3 討論

肝癌作為臨床常見的惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，臨床診斷多為中晚期，手術治療后5年生存率較低[1]。臨床常采用腫瘤分化程度和淋巴結轉移等傳統(tǒng)病理特征來評估患者生存期，但其效果并不理想[3]。近年研究表明，lncRNAs 的異常表達與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關，發(fā)現(xiàn)其可以通過影響mRNA 的穩(wěn)定性及翻譯、蛋白質修飾過程，作為競爭性內源RNA 或mRNA 前體發(fā)揮功能，也可招募相關因子改變染色質結構影響基因表達，廣泛參與疾病生理、病理過程[17-18]。如既往研究報道，PTENP1 可競爭性吸附miR-20a，miR-19b，減少其與3'UTR 結合，從而抑制腫瘤的發(fā)展[19]；lncRNA CASC15 在肝癌中通過SOX4 /Wnt/β-catenin 信號通路促進腫瘤進展[20]。提示lncRNAs 與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，故積極探究更多特異性lncRNAs 對肝癌臨床研究具有重要意義。

本研究前期通過檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，除既往研究報道的lncRNAs 外，PRR34-AS1 在肝癌組織中也異常高表達。最新研究也表明，PRR34-AS1 通過吸附microRNA-498 可上調FOXO3 表達，加速肝細胞癌的發(fā)展進程[14]。PRR34-AS1 使miR-498 海綿化促進了TOMM20 和ITGA6 介導的肝癌進展[15]，更加證實了其在肝癌發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。基于目前國內外關于PRR34-AS1 的研究報道有限，其調控肝癌發(fā)生發(fā)展的作用機制尚未探明且相關報道鮮少，故研究擬探究PRR34-AS1在肝癌中的表達，以及對肝癌細胞生物學行為的影響及潛在分子作用機制。首先，研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中PRR34-AS1 顯著高表達，同時檢索GEPIA 數(shù)據(jù)庫證實肝癌組織中PRR34-AS1 高表達且具有高表達預后差的臨床特征，提示其可能扮演原癌基因角色發(fā)揮作用。通過轉染siRNA 介導敲低PRR34-AS1 表達，經(jīng)細胞實驗探究發(fā)現(xiàn)，敲低PRR34-AS1 表達顯著抑制了肝癌細胞的增殖、遷移速率，確定了其致癌基因屬性，與既往研究相符。

近年研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多基因參與調控的極其復雜的過程，除癌基因的激活和抑癌基因的失活外，信號通路也參與其中[7]。JAK / STAT 信號通路是細胞因子信號傳導的下游通路，研究發(fā)現(xiàn)其能調控細胞的分化、增殖及凋亡等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉移及耐藥機制形成中起著重要作用[21]。Janus 激酶（JAK）屬于非受體酪氨酸激酶家族，由JAK1，JAK2，JAK3 和TYK2 組成，可響應各種細胞因子和生長因子激活信號轉導子和轉錄激活子（STAT）蛋白[22-23]。STAT 在包括肝細胞癌（HCC）、頭頸癌、乳腺癌和肺癌等不同類型的人類癌癥中異常激活，而JAK 是調控激活STAT酪氨酸激酶功能的主要因素，提示被激活的JAK1/STAT3 信號傳導與腫瘤發(fā)生和癌癥進展有關[24-26]。正常情況下，機體可通過JAK 和STAT 反饋調節(jié)模式來維持動態(tài)平衡狀態(tài)；當機體發(fā)生病變時，JAK蛋白被激活后發(fā)生磷酸化，其信號傳導途徑被打開，導致STAT 蛋白中的酪氨酸殘基被磷酸化形成同源二聚體，其與細胞核中的靶基因結合，從而進行調控表達[24,26]。另據(jù)相關報道，JAK/STAT 信號通路在正常細胞中受到嚴格調節(jié)，且由于癌細胞中JAK 家族激酶或其他酪氨酸激酶的異常激活而被持續(xù)激活[27]。而在JAK/STAT 家族成員中，JAK1/STAT3 在許多生物學過程（例如細胞生長、凋亡、遷移和侵襲）中起著至關重要的作用[28]。JAK1 刺激STAT3 磷酸化可促進細胞增殖、遷移、侵襲和血管生成[29-30]。相關研究也表明[31]，JAK/STAT 信號通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，抑制該通路則顯著抑制了體內HCC 細胞的生長。本研究經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，PRR34-AS1 能夠調控JAK1 基因表達，PRR34-AS1 過表達通過阻斷JAK1 依賴的JAK/STAT 信號通路能夠促進丙泊酚預處理對全膝關節(jié)置換術后小鼠缺血/再灌注損傷的保護[17]，提示PRR34-AS1 發(fā)揮作用與JAK/STAT 通路間的緊密性。研究經(jīng)熒光霉素實驗證實PRR34-AS1 與JAK1 確實存在相互結合位點，JAK1 是PRR34-AS1 的靶基因，且探究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中JAK1 也顯著高表達，與PRR34-AS1 呈顯著正相關；同時JAK1 表達受PRR34-AS1 調控，敲低JAK1 表達明顯抑制了肝癌細胞增殖速率；細胞回補實驗證實，在敲低PRR34-AS1 表達的肝癌細胞中回補JAK1后肝癌細胞增殖、遷移速率恢復到正常水平，由此初步證明了PRR34-AS1 促進肝癌細胞增殖和遷移是通過正調控JAK1 表達來實現(xiàn)。然而癌基因參與調控腫瘤發(fā)生的機制及信號通路復雜，研究對PRR34-AS1 調控JAK/STAT 信號通路發(fā)揮作用參與肝癌發(fā)生發(fā)展的機制較表淺，因此后期還需通過體內體外試驗進一步深入探討兩者間的調控作用關系，以期得出更精確結論用于臨床指導。

綜上所述，肝癌中PRR34-AS1 顯著高表達，敲低PRR34-AS1 則顯著抑制了肝癌細胞的增殖和遷移，其可能通過正向調控JAK1 表達影響JAK/STAT信號通路，進而發(fā)揮作用參與肝癌的惡性進展。