慢阻肺急性加重患者外周血單核細胞CD64，TLR2及TLR4水平表達與預后的關系研究

鄒 雯，王婷婷，王一江 （南京醫(yī)科大學附屬江蘇盛澤醫(yī)院呼吸內科，江蘇蘇州 215200）

慢阻肺急性加重（acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD）患者氣喘、咳嗽咳痰等癥狀加重，AECOPD 會增加患者醫(yī)療開銷，加重患者疾病負擔[1]。目前，氣道炎癥及細菌感染被認為是慢阻肺（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）的主要致病機制。簇分化抗原64（cluster of differentiation antigen ,CD64）是激活單核細胞及粒細胞，引起炎癥的重要分子物質，當發(fā)生細菌感染時，外周血單核細胞表面CD64 表達將異常上升，史萌萌等[2]研究發(fā)現(xiàn)，檢測外周血CD64 表達水平在預測AECOPD 患者不良預后中具有一定的價值。此外，機體免疫功能下降也與COPD 發(fā)病相關，Toll 樣受體（toll-like receptors,TLR）是天然免疫中新發(fā)現(xiàn)的一類模式識別受體家族，單核細胞主要表達Toll 樣受體2（To ll-like receptor 2, TLR2）與Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4, TLR4），TLR 可作為病原相關分子模式識別受體（pattern-recognition receptors, PRR）與配體直接結合，參與機體非特異性免疫[3,4]。謝圓媛等[5]研究發(fā)現(xiàn)，不吸煙的COPD 穩(wěn)定期患者外周血TLR2 及TLR4 水平明顯高于AECOPD 患者及吸煙患者，且外周血TLR2 及TLR4 水平與患者血清炎癥因子水平間有較高的相關性，提示其可能參與COPD 發(fā)生及發(fā)展。以上研究表明，外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平可能與COPD 及AECOPD 的發(fā)生及發(fā)展有關，但相關研究較少，故本研究擬通過檢測AECOPD 患者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平，分析其在預測AECOPD 患者預后中的價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 將南京醫(yī)科大學附屬江蘇盛澤醫(yī)院2017.06～2020.06 期間收治的96 例慢阻肺急性加重（AECOPD）患者納為研究對象，同時將30 例穩(wěn)定期COPD 患者納為穩(wěn)定組，30 例健康志愿者納為對照組。①納入標準：COPD 患者均符合《慢阻肺診斷、治療與預防全球倡議（GOLD）》中相關診斷標準，AECOPD 患者具有呼吸困難、慢性咳嗽咳痰癥狀，持續(xù)性氣流受限，短期內咳嗽、喘息、咳痰等癥狀加重，需改變治療方案；穩(wěn)定期患者病情穩(wěn)定持續(xù)時間超過1 個月患者；健康志愿者為健康體檢合格，無COPD 病史、慢性咳嗽、喘息、咳痰者。②排除標準：排除參與研究前15 天內使用糖皮質激素者；并發(fā)惡性腫瘤者；并發(fā)其他部位感染者。③病例資料：對照組男性19 例，女性11 例，年齡55～85 歲，平均年齡72.45±13.33 歲；AECOPD 組男性63 例，女性33 例，年齡56～87 歲，平均年齡71.15±12.03 歲，COPD 組男性19 例，女性11 例，年齡55～87 歲，平均年齡73.15±12.69 歲。三組年齡及性別比例無顯著性差異（P>0.05），本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，參與者均知情且簽署同意書。

1.2 儀器與試劑 美國BD 公司FACS Calibur 流式細胞儀，IL-6 采用電化學發(fā)光法檢測，PCT 采用發(fā)光免疫法檢測，試劑盒均購自美國Beckman 公司，白細胞計數(shù)（WBC）由美國Beckman 公司全自動血細胞分析儀檢測，CD64-PE 單抗（Clone:10.1，Cat No12-0649-73）、鼠IgG1-PE（Clone:P3.6.2.8.1，Cat No12-4714-82）均購自美國eBioscience 公司，肺功能檢測儀為麥邦MSA99。

1.3 方法 ①外周血單個核細胞（PBMC）提取：采集被研究者空腹靜脈血5ml，EDTA 抗凝，采用Ficoll Paque 分離液提取患者外周血PBMC。②流式細胞儀檢測CD64 表達水平：分別于兩支試管內加入CD64-PE（測定）與鼠IgG1-PE（對照），分別加入全血50μl，避光環(huán)境中靜置15min，滴加溶血素50μl，棄上清液，300×g 離心5min，棄上清液，加入等滲鹽水洗滌后，使用流式細胞器檢測CD64 表達水平，單核細胞表面的CD64 表達采用相對熒光強度（RFI）表示，RFI=目的細胞CD64 平均熒光強度/目的細胞陰性對照熒光強度。③ 流式細胞儀檢測PBMC TLR2 及TLR4 的表達：經Cellquestpro 統(tǒng)計軟件獲取分析，共收獲10 000個細胞，以APC-CD14/SCC 散點圖設單核細胞門R1，以FSC/SCC 散點圖設淋巴門R2，細胞碎片根據SSC 特征排除，單核細胞中TLR2 及TLR4 表達以直方圖表示，以平均熒光強度（MFI）表示單核細胞及淋巴細胞中TLR2 及TLR4 表達強度。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較使用單AVNA 檢驗，檢驗有意義者，兩兩比較采用q檢驗；計數(shù)資料用[n(%)]表示，兩組間比較采用χ2檢驗，用二元Logistic 回歸計算聯(lián)合檢測AECOPD 再次復發(fā)的預測值，繪制受試者特征工作曲線（receiver operating characteristic curve,ROC）評價單個或多個指標聯(lián)合檢測預測AECOPD 再次復發(fā)的性能，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比較 見表1。AECOPD 組及COPD 組外周血CD64 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且AECOPD 組CD64 水平高于COPD 組，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.466,P<0.05），AECOPD 組及COPD組外周血TLR2 及TLR4 水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且AECOPD 組外周血TLR2 及TLR4 水平高于COPD 組，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.249, 2.037, 均P<0.05）。

表1 三組外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比較(±s)

表1 三組外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比較(±s)

項 目 對照組（n=30） COPD 組（n=30） AECOPD 組（n=96） F P CD64（MFI） 26.74±5.14 32.69±6.43 39.69±7.79 51.774 0.000 TLR2 140.0 3±28.74 169.79±29.07 181.15±22.44 26.957 0.000 TLR4 153.65±35.14 186.25±34.15 200.58±33.47 21.488 0.000

2.2 AECOPD 及COPD 組患者臨床指標比較 見表2。AECOPD 組患者FEV1/FVC 水平低于COPD組，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.523,P<0.05），血清PCT，IL-6 及WBC 水平高于COPD 組，差異均有統(tǒng)計學意義（t=12.443, 8.019, 3.690, 均P<0.05），兩組年齡、性別比例、吸煙史及FEV1%pred 水平差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 AECOPD 及COPD 組患者臨床指標比較

2.3 不同預后AECOPD 患者外周血CD64，TLR2及TLR4 水平比較 見表3。隨訪6 個月，96 例AECOPD 患者中共20 例患者因再次急性復發(fā)入院，再次復發(fā)者首次入院時外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平均高于無復發(fā)者，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

表3 不同預后AECOPD 患者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平比較（MFI）

2.4 AECOPD患者外周血CD64，TLR2 及TLR4水平與其他臨床指標間的相關性分析 見表4。AECOPD 患者外周血CD64 與其吸煙史、PCT，IL-6水平呈正相關，與FEV1/FVC 呈負相關，差異有統(tǒng)計學意義（r=0.31, 0.33, 0.16, -0.45, 均P<0.05），TLR2 與其FEV1/FVC 呈負相關，與PCT 水平呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義（r= -0.35, 0.34,P<0.05），TLR4 與其他臨床指標無相關性（P>0.05）。

表4 AECOPD 患者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平與其他臨床指標間的相關性分析

2.5 外周血CD64，TLR2，TLR4 在預測AECOPD預后中的價值 見表5，圖1。繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，血清CD64，TLR2 及TLR4 在預測AECOPD 患者再次急性復發(fā)中均具有良好的應用效能，各指標單獨應用時以TLR2 應用效能最高，其AUC=0.805，95%CI(0.679～0.931)，三指標聯(lián)合應用的預測效能最高，AUC=0.833，95%CI(0.703～0.964)。

表5 外周血CD64，TLR2，TLR4 在預測AECOPD 預后中的價值

圖1 外周血CD64，TLR2 及TLR4 在預測 AECOPD 預后中的價值

3 討論

COPD 是一種以持續(xù)性氣流受限為主要特征的慢性呼吸性疾病，其患病率高，是目前重要的公共衛(wèi)生問題，COPD 病因復雜，病情多變，當疾病急性發(fā)作時，死亡率也較高。準確評估患者病情嚴重程度，預測其預后，在疾病的治療中具有重要的意義。篩選適當?shù)难笜耍糜谂R床AECOPD病情及預后評估，是目前研究的熱點。胡小燕等[6]研究發(fā)現(xiàn)，血清降鈣素原（procalcitonin, PCT）以及B 型腦利鈉肽（B type brain natriuretic peptide, BNP）在診斷AECOPD 并發(fā)心力衰竭中具有良好效能，提示血生化指標在AECOPD 中的應用價值較高。本研究以CD64，TLR2 以及TLR4 作為研究指標，旨在探討以上指標在AECOPD中的應用價值。

CD64 是IgG Fc 段受體Ⅰ，中性粒細胞活化的標志物，是一種高親和性受體，主要于單核細胞與巨噬細胞表面表達。CD64 是連接機體體液免疫及細胞免疫的橋梁，參與細胞吞噬、清除免疫復合體、刺激炎性介質釋放等多種生理病理過程[7-8]。單核細胞是巨噬細胞的前體，本院研究發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者外周血單核細胞上CD64 表達水平明顯高于COPD 患者及健康志愿者，且與患者肺功能指標FEV1/FVC，炎癥指標CRP，PCT 間存在相關性，說明外周血CD64 水平升高在反映AECOPD 患者機體肺功能及炎癥反應強度中具有一定的應用價值。羅成等[9]研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥肺損傷者外周血CD64指數(shù)明顯高于單一的膿毒癥患者，且CD64 水平與炎性指標CRP 間呈正相關，與本文研究結論相似。有研究表示，IL-6 及CRP 等炎性因子可與單核細胞上的CD64 相互結合，誘導黏附的單核細胞釋放CCL2，CCL3 等趨化因子，減少單核細胞相應趨化因子受體的表達，進而減少單核細胞對趨化因子的誘導移行，導致單核細胞大量定居在氣管內，募集更多的循環(huán)炎癥細胞，加重患者病情[10]。以上研究均證實，CD64 在提示COPD 病情嚴重程度中具有一定的價值，且本文通過繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，CD64 在預測AECOPD 預后中的AUC=0.756，進一步說明CD64 在預測AECOPD 患者預后中的價值。

除炎癥的影響外，COPD 的發(fā)生及發(fā)展與患者機體免疫力之間也存在密切聯(lián)系，故篩選合適的免疫性指標，用于COPD 病情的評估，也具有一定的研究意義。其中，Toll 樣受體（TLR）屬于天然免疫系統(tǒng)，屬于模式識別受體家族，是天然免疫與適應性免疫之間的橋梁。感染是引起COPD 及AECOPD 的重要原因，作為宿主防御體系的重要成員，TLR 的表達分布及功能可能與COPD 間存在密切的關系[11]。

TLR2 可通過激活機體免疫細胞，促進炎癥介質及趨化因子的釋放[12]。TLR4 是脂多糖（LPS）受體復合物中的重要組成部分，TLR4 調節(jié)LPS 促使免疫細胞與非免疫細胞釋放致炎性細胞因子及化學因子導致內毒素性休克過程。細菌感染可通過刺激樹突狀細胞通過TLR4 途徑促使β2 防御素產生增多[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，AECOPD 患者外周血核細胞中TRL2 及TRL4 水平明顯高于COPD 組及健康志愿者，提示AECOPD患者免疫系統(tǒng)處于活化狀態(tài)，作為機體一線防御功能的單核細胞，其在進入靶器官前處于一種活化狀態(tài)，能表達多種模式識別受體，識別靶器官抗原[14]。TRL2 及TRL4 高表達可能促進AECOPD 患者外周血單核細胞活化，TLR 通過激活患者機體免疫細胞，促進炎癥介質及趨化因子的釋放，募集更多的炎癥細胞浸潤于氣管內，加重患者臨床癥狀[15]。

相關性分析提示，AECOPD 患者外周血單核細胞TLR2 表達水平與其FEV1/FVC 呈負相關，與PCT 水平呈正相關，而TLR4 與其他臨床指標無相關性，這可能與本研究樣本有限相關。此外，隨訪半年，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，半年內AECOPD 再次復發(fā)者外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平明顯高于未復發(fā)者，繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，外周血CD64，TLR2 及TLR4 水平在預測AECOPD 再次復發(fā)中具有良好的效能，三者聯(lián)合應用則可有效提高各項指標單獨應用時的應用效能。外周血單核細胞CD64，TLR2及TLR4 的檢測方法簡單，取材方便，且在反映AECOPD 病情中具有較好的效能，可作為臨床評估AECOPD 預后的可靠指標，但本研究所納入的樣本量較小，且為單中心研究，患者信息存在時效性差，在病例選擇上也存在選擇偏倚，后應擴大研究樣本以控制偏倚。

綜上所述，AECOPD 患者外周血CD64，TLR2及TLR4 水平均較COPD 者明顯升高，且其在預測患者半年內再次急性復發(fā)中具有良好的效能，有望作為臨床預測AECOPD 患者預后的參考指標。