靶向高通量測序檢測卵巢癌患者易感基因突變與臨床特征的相關性研究

馬占忠 ，許紅雁，胡紅波，劉玉蘭，陳偉娟，肖鳳金，梁慶雲，葉美嫻

（汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院 a. 檢驗科；b. 婦科；c. 生物樣本庫，廣東韶關 512026）

卵巢癌是嚴重危害女性健康的三大惡性腫瘤之一，病死率居婦科惡性腫瘤首位，據WHO 報道：2018年全球新增卵巢癌患者約29.54 萬例，死亡18.4 萬例[1-2]。由于缺乏早期特異性標志物及臨床癥狀，卵巢癌難以早期發現，大多數患者確診時已到晚期[3]，而且預后極差，總體5年生存率僅有30%～40%[4-5]。BRCA1/2 基因突變會增加患卵巢癌的風險，約20%的卵巢癌患者存在BRCA1/2 基因突變[6-8]。因此，尋找卵巢癌早期檢測的新靶點及防治策略是全球關注的焦點和難點。卵巢癌中10%～15%為遺傳性卵巢癌[9]，這部分人群可以通過基因檢測做到早期診斷和精準靶向用藥治療，降低卵巢癌的死亡率。并通過評估其家屬的患癌風險，采取科學干預措施，降低卵巢癌的發病率。在精準醫學時代，下一代測序技術（next-generation sequencing, NGS)在臨床上的廣泛應用，對卵巢癌的個體化診療產生了深遠影響[10]。本研究利用靶向高通量基因測序技術對21 種卵巢癌易感基因進行測序。繼而分析攜帶胚系基因突變和臨床特征的相關性，為卵巢癌的個體化精準診療和預防提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2018年1月～2020年12月在粵北人民醫院就診的35 例卵巢癌患者的外周血標本和臨床資料，中位年齡50.2 歲（范圍31～74 歲），所有病例均經過組織病理學確診為卵巢癌。腫瘤分期根據國際婦產科聯合會（FIGO）和世界衛生組織（WHO）標準。入組患者進行BRCA1/2 等21 種易感基因的胚系突變檢測，從病歷中收集患者臨床病理、家族史、診療等信息。本研究經粵北人民醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 Covaris LE220 超聲波破碎儀，Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀，Qubit3.0 熒光定量分析儀、ABI StepOne 熒光定量PCR 儀和Illumina HiSeq2500 高通量測序儀等。QIAamp DNA Blood Midi Kit 提取DNA 試劑盒，華大基因文庫構建和測序試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA 提取：采集患者靜脈血5ml，EDTA-K2抗 凝， 按 照QIAamp DNA Blood Midi Kit 試劑盒說明書提取人外周血單個核細胞基因組DNA。

1.3.2 文庫構建：將提取的基因組DNA 利用Covaris LE220 超聲波破碎儀打斷成200 ～250 bp的片段，進行Ampure Beads 純化，將純化后的DNA 片段末端修復、加“A”以及加接頭反應，完成文庫構建。

1.3.3 雜交捕獲：Non-Captured 樣品進行LM-PCR反應、純化，利用基因片段捕獲探針，65℃雜交捕獲24h，雜交結束后進行洗脫，隨后進行Captured 樣品的LM-PCR 反應。文庫經Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀和 ABI StepOne 熒光定量PCR 儀檢測片段大小和濃度。

1.3.4 基因測序：使用Illumina HiSeq2500 基因測序儀進行雙向測序，測序覆蓋目標基因外顯子及其鄰近±20bp 內含子區，包括BRCA1，BRCA2，CHEK2，PALB2，BRIP1，TP53，PTEN，STK11，CDH1，ATM，BARD1，MLH1，MRE11A，MSH2，MSH6，MUTYH，NBN，PMS1，PMS2，RAD50 和RAD51C 共21 種基因。

1.3.5 生物信息學分析：用Illumina Pipeline software(v 1.3.4) 對原始數據進行自動處理和分析，用BWA(Burrows Wheeler Aligner)軟件與HG19 進行序列比對，同時評價序列捕獲效果。用SOAPsnp軟件和Samtools 軟件進行SNV(single nucletide variant) 和Indel(insertion and deletion)的分析，查詢COSMIC(https://cancer.sanger.ac.uk /cosmic)，dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)，TP53 數據庫(http://p53.iarc.fr/Protocolsand Tools.aspx), Hap-Map, 1000 human genome dataset 和 database of 100 Chinese healthy adults 等數據庫，對基因突變位點進行歸類和注釋。

1.4 統計學分析 采用SPSS22.0 軟件進行統計學分析。計數資料以n（%）表示，組間比較采用卡方檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌患者臨床病理特征 35 例卵巢癌患者中，年齡＜50 歲12 例（34.3%），年齡≥50 歲23例（65.7%）；組織類型中高級別漿液性卵巢癌27例（77.1%），其他類型8 例（22.9%）；FIGO 分期I～II 期9 例（25.7%），III～IV 期26例（74.3%）；有腫瘤家族史15 例（42.9%），CA-125中位數755.3U/ml（范圍7.9～10 000.0U/ml）。

2.2 卵巢癌患者胚系基因突變分布 見表1。35例卵巢癌患者中檢出已知致病突變19 例，突變率54.3%，其中BRCA1 基因突變7 例，BRCA2 基因突變4 例，RAD51C 基因突變2 例，CHEK2，ATM，RAD50，MSH2，MRE11A 和TP53基因突變各1 例，這19 種突變類型中有17 種已在公共數據庫中有報道，另外，發現兩種新的基因突變，包括BRCA1 基因c.438delC 和RAD51C 基因c.390_391delAA。

表1 卵巢癌患者胚系基因突變分布

2.3 主要基因突變與臨床病理特征的關系 見表2。卵巢癌患者多以高級別漿液性卵巢癌晚期為主，BRCA1 和BRCA2 是卵巢癌最主要的胚系突變基因。BRCA1/2 基因突變和組織類型相關（P=0.034），和家族史顯著相關（P=0.003），與年齡和FIGO 分期無顯著相關性（P>0.05）。

表2 主要基因突變與臨床病理特征的相關性分析[n=35, n(%)]

3 討論

本研究結果發現卵巢癌患者易感基因突變率為54.3%，BRCA1 基因突變率最高(20.0%)，其次是BRCA2 基因突變率(11.4%)，BRCA1 和BRCA2 是卵巢癌中最主要的胚系突變基因，并且該基因突變與遺傳性卵巢癌顯著相關。檢測出的突變類型有框移突變、剪接突變和錯義突變，所有突變均為雜合子和常染色體顯性遺傳。其中由基因缺失引起的框移突變占42.1%，該類突變可能導致基因編碼蛋白異常。新發現的BRCA1 基因c.438delC 和RAD51C基因c.390_391delAA 突變在公共數據庫中尚未見報道，有待于進一步擴大病例數深入研究。另外，研究發現BRCA1/2 基因突變頻率高，且無熱點突變，所以傳統的熒光定量PCR 不適宜做BRCA1/2基因突變檢測，測序是檢測此類基因突變的最佳技術手段。

卵巢癌的發生本質上是基因突變和免疫逃逸所致，對高危人群進行易感基因篩查是卵巢癌早期診斷的有效手段[11]。本研究結果也證實了BRCA1/2 基因突變與遺傳性卵巢癌發病密切相關。BRCA1 和BRCA2 分別定位在人類染色體17q21 和13q12，具有調節細胞周期、調控轉錄及DNA 修復等作用，基因發生突變使得細胞的正常調節失活，引起細胞異常生長，最終發生腫瘤[12-13]。一般人群中卵巢癌終生發病風險約為1.5%，而BRCA1和BRCA2 基因突變攜帶者患卵巢癌的風險分別是25%～65%和15%～20%[14]。美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）在遺傳性乳腺癌及卵巢癌綜合征檢測標準中，建議應對有家族史的人群檢測BRCA1 和BRCA2 基因，對于攜帶已知致病性突變的人群應加強健康管理，以利于早期發現和干預[15]。

卵巢癌腫瘤細胞和胚系細胞中主要的突變基因有差異。KWONG 等[16]應用高通量測序檢測卵巢癌患者體細胞易感基因，排在前五的突變是TP53(52.9%)，KRAS(23.5%)，PIK3CA(11.8%)，BRCA1(5.9%) 和RB1(5.9%)。GARZIERA 等[17]在遺傳性卵巢癌腫瘤細胞中檢出最主要的突變是TP53(72.1%)， KRAS (8.9%)，FBXW7(3.8%)，PTEN (3.8%)和 PIK3CA (3.8%)，研究結果顯示腫瘤細胞中以TP53 突變為主，而胚系細胞中則以BRCA1/2 突變為主[18]。2013年5月14日，國際影星安吉麗娜·朱莉(Angelina Jolie)公布了她檢測到BRCA1 基因有突變，加之母親患乳腺癌，評估其罹患乳腺癌和卵巢癌的風險分別高達87%和50%的情況下，她選擇了雙側乳房切除術預防腫瘤的消息[19]。此事除明星效應引起全球關注外，也引發了醫學界對預防性器官切除及醫療指征的熱議[20]。目前，國外醫療機構已廣泛開展遺傳性腫瘤的基因測序和遺傳咨詢[21]，國內腫瘤基因測序在臨床上的應用也取得了一定的進展[22-23]。隨著高通量基因測序在遺傳性腫瘤防治中的應用，使得腫瘤的防治有了重大突破，腫瘤患者的生存獲益有了質的飛躍[24-26]。基于高通量測序技術的臨床研究必將極大地推動以基因大數據與個體化診療為特征的精準醫學的發展，影響和改變我們的臨床實踐，具有臨床推廣應用前景。