干式熒光發(fā)光法快速檢測梅毒螺旋體抗體的方法建立和初步應(yīng)用與評價

呂松琴，孫溪若，黃 山，段洪芬，施金麗，李曉非，王超男，張 玲，王義娜

（1. 昆明市第三人民醫(yī)院/云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，昆明 650041； 2. 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，上海 201108；3. 東方海洋（北京）醫(yī)學(xué)研究院，北京 100071）

近年來梅毒的發(fā)病率逐年增加，在國家法定傳染病中位居第3 位，成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，TP) 感染引起的性傳播疾病[1-2]，早期梅毒傳染性最強，隨后逐漸減弱；同時早期梅毒的臨床治愈率顯著高于二、三期梅毒，因此對梅毒的早期診斷和治療就顯得格外重要[3-4]。梅毒的診斷主要依靠實驗室檢測，尤其是血清學(xué)檢查[5]。目前使用ELISA 或化學(xué)發(fā)光法檢測梅毒螺旋體特異性抗體[6-7]，但這些方法檢測往往需要1～2 h，不適合臨床快速篩查。故本研究基于免疫層析和熒光發(fā)光平臺，利用高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原，擬建立一種干式熒光發(fā)光快速檢測特異性梅毒螺旋體總抗體的檢測技術(shù)，并對其檢測性能進(jìn)行初步評價。

1 材料與方法

1.1 研究對象 109 例經(jīng)臨床確診的梅毒患者、44例其他疾病對照組患者和207 例健康體檢者血清樣本由昆明市第三人民醫(yī)院檢驗中心于2020年7月～2021年3月期間收集，保存于-80℃?zhèn)溆谩?09例經(jīng)臨床確診的梅毒患者平均年齡43.8±17.2 歲，其中男性44 例，女性65 例；44 例其他疾病對照組患者平均年齡45.7±14.5 歲，其中男性23 例，女性21 例；207 例健康體檢者平均年齡43.8±10.9 歲，其中男性85 例，女性122 例。三組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究獲得昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 儀器與試劑 兔IgG 和羊抗兔IgG 購自北京華信行生物技術(shù)有限公司；BSA 購自Sigma 公司；熒光微球購自上海邁普生物科技有限公司；玻璃纖維素墊、硝酸纖維素膜（NC 膜）等耗材購于上海杰一生物技術(shù)有限公司；梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品（批號：370035-201801）購自中國食品藥品檢定研究院；梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購自上海科華生物工程股份有限公司。ELx405 深孔板洗板機和ELx-808 吸收光酶標(biāo)儀購自美國Bio-TeK 公司；AFS-1000 干式熒光免疫分析儀購自廣州藍(lán)勃生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TP 抗原的表位分析：采用BIOSUN 生物信息學(xué)軟件，分別輸入TP47，TP17 和TP15 抗原氨基酸序列，然后利用B 細(xì)胞表位分析功能，根據(jù)表位峰值的高低分析篩選優(yōu)勢表位區(qū)段。

1.3.2 高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原的制備：根據(jù)NCBI 公布的TP 抗原的核酸序列，將TP47，TP17和TP15 三種抗原優(yōu)勢表位區(qū)段的核酸序列進(jìn)行連接獲得基因序列，序列合成由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。將高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原的基因序列連接入pET-28a 載體，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-TP47-17-15，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21，將含有測序正確目的基因的大腸埃希菌菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。收集誘導(dǎo)后的菌體，超聲波破碎，收集上清液進(jìn)行Ni 柱純化，洗脫收集目的蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.3.3 干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測卡建立：用包被稀釋液將高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原稀釋至最佳包被濃度；將羊抗兔IgG 稀釋成最佳包被濃度；用劃膜儀將兩種包被液分別噴到硝酸纖維素膜上。將已包被的硝酸纖維素膜37℃干燥24 h。將最佳標(biāo)記濃度的高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原與微球按最佳比例進(jìn)行偶聯(lián)制得微球標(biāo)記抗原溶液。將微球標(biāo)記抗原溶液調(diào)整至最佳濃度，以最佳量噴至玻璃纖維墊上制備成TP 微球結(jié)合墊。將TP 微球結(jié)合墊室溫干燥12h。在干燥室內(nèi)將反應(yīng)膜、兔IgG 微球結(jié)合墊、TP 微球結(jié)合墊、樣品墊、濾紙等裝配成反應(yīng)板，再用切條機切成試紙條組裝成ID 卡，裝入鋁箔袋內(nèi)。檢測時，陽性樣本中的TP 抗體先與固化在玻璃纖維上的熒光微球標(biāo)記的高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原結(jié)合形成復(fù)合物，并繼續(xù)向NC 膜層析，通過NC 膜檢測線（T 線）時，被包被在NC膜上的高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原捕獲。儀器顯示結(jié)果為S/CO 值，S 代表待測樣本T 線熒光值和C 線熒光值比值（T/C），CO 為Cut-off值，S/CO值≥1，結(jié)果為陽性；S/CO 值＜1，結(jié)果為陰性。

1.3.4 臨界值（Cut-off值）的確定：選取120 例經(jīng)酶聯(lián)免疫法檢測確認(rèn)為TP 抗體陰性的健康體檢血清樣本，采用本研究檢測技術(shù)進(jìn)行檢測，分別記錄T 線熒光值和C 線熒光值，并計算比值（T /C），然后計算T /C 的平均值（X）和標(biāo)準(zhǔn)差（S），以x±2s為Cut-off值。

1.3.5 干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測試劑性能評估：根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》和中國合格評定國家認(rèn)可委員會頒布實施的《臨床免疫學(xué)定性檢驗程序性能驗證指南》，采用梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品評估陽性符合率、陰性符合率、最低檢測限、批內(nèi)重復(fù)性、批間重復(fù)性；采用臨床樣本評估臨床敏感度、特異度、陰性預(yù)期值、陽性預(yù)期值、似然比。梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品包含10 份陽性參考品（P1～P10），20 份陰性參考品（N1～N20），3 份最低檢測限參考品（L1～L3）和1 份重復(fù)性參考品（CV）。

1.3.6 臨床樣本檢測

1.3.6.1 酶聯(lián)免疫法：應(yīng)用雙抗原夾心原理，檢測人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀讀數(shù)，波長450 nm。以S/CO 值≥1.0 為陽性，S/CO 值＜1.0 為陰性。

1.3.6.2 干式熒光發(fā)光法：應(yīng)用雙抗原夾心原理，檢測人血清或血漿中的梅毒螺旋體抗體。用移液器分別吸取100μl 血清/血漿樣本，加入到檢測卡上加樣孔中。檢測卡加樣反應(yīng)15 min 后立即上機檢測分析結(jié)果并輸出報告。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計數(shù)資料比較采用Kruskal-Wallis 檢驗，兩組間比較采用ANOVA 方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。運用GraphPad Prism 5 軟件繪制ROC 曲線，并計算敏感度與特異度。等效性采用Kappa 檢驗，Kappa 值在0～1 之間，越接近1 說明兩種試劑檢測結(jié)果的一致性越好。

2 結(jié)果

2.1 TP 抗原的優(yōu)勢表位篩選 見圖1。利用BIOSUN 生物信息學(xué)軟件分析確定優(yōu)勢表位區(qū)段分別為20～170aa（TP47），30～150aa（TP17）和22～80aa（TP15）。

圖1 TP 抗原的B 細(xì)胞表位分布圖

2.2 高活性優(yōu)勢表位嵌合TP抗原的制備 見圖2。高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原為可溶性表達(dá)，Ni 柱純化后獲得純化抗原，經(jīng)SDS-PAGE 電泳鑒定，結(jié)果顯示抗原相對分子量約為37.9kDa。

圖2 高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原SDS-PAGE 電泳鑒定

2.3 干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測技術(shù)分析性能評估 通過對120 例經(jīng)酶聯(lián)免疫法檢測確認(rèn)為陰性的健康人群血清樣本的檢測，確定本研究干式熒光發(fā)光法TP 抗體檢測技術(shù)的Cut-off值為0.172。以本研究技術(shù)檢測梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品，結(jié)果見表1。10 份陽性參考品檢測均為陽性，符合率為10/10；20 份陰性參考品檢測19 份為陰性，符合率為19/20；三批產(chǎn)品的批內(nèi)重復(fù)性分別為12.00%，12.30%和9.10%，批間重復(fù)性為10.90%，均≤20%；3 份最低檢測限參考品L1 和L2 檢測為陽性，L3 檢測為陰性，以上各項均符合國家參考品檢測要求。

表1 梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品檢測結(jié)果

2.4 臨床應(yīng)用評價

2.4.1 臨床樣本檢測：采用本研究所建立的干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測技術(shù)對360 例臨床樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖3。兩組間方差分析顯示，梅毒患者血清中抗TP 總抗體水平（S/CO：3.942±1.980）與其它疾病對照組和健康對照組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）；其它疾病對照組（S/CO：0.676±1.169）與健康對照組（S/CO：0.199±0.275）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)ROC 曲線，本研究檢測技術(shù)診斷梅毒患者的AUC 值為0.986（95% CI：0.975～0.996），S/CO=1 為臨界值，檢測敏感度為99.08%（95% CI：94.99%～99.98%）（108/109），特異度為94.02%（95% CI：90.37%～96.63%）（236/251）；陽性預(yù)測值為87.80%，陰性預(yù)測值為99.58%；陽性似然比為16.569，陰性似然比為0.009 8。

圖3 干式熒光發(fā)光法TP 總抗體檢測技術(shù)檢測性能

2.4.2 干式熒光發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法比較：見表2。平行檢測360 例臨床樣本，以酶聯(lián)免疫法試劑檢測結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，干式熒光發(fā)光法與酶聯(lián)免疫法的陽性符合率為96.77%（120/124），陰性符合率為98.73%（233/236），總體符合率為98.06%（353/360），兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），Kappa指數(shù)為0.965，表明兩種方法具有高度一致性。

表2 360 例臨床樣本的平行檢測結(jié)果

3 討論

準(zhǔn)確快速地檢測梅毒對于臨床輸血安全以及傳染病防控具有重要作用。傳統(tǒng)的梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗雖然是梅毒螺旋體抗體檢測金標(biāo)準(zhǔn)，但由于天然抗原不易獲得造成試劑昂貴，限制了其在臨床上的應(yīng)用[6,8]。近年來，采用基因重組技術(shù)制備的TP 抗原逐漸代替天然抗原，基于重組抗原建立起來的酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、膠體金免疫層析法等檢測技術(shù)也在臨床上得到廣泛應(yīng)用[9-11]。

梅毒螺旋體抗原中TP47，TP17 和TP15 三個脂蛋白具有較強的抗原性。TP47 被認(rèn)為是梅毒螺旋體豐度最高、免疫性最強和特異度最好的抗原，TP17和TP15 雖然含量較低，但無論在人體內(nèi)還是動物實驗都表明具有很強的免疫原性，單獨或聯(lián)合作為包被抗原表現(xiàn)出較好的敏感度和特異度[12-14]。在本研究中所采用高活性優(yōu)勢表位嵌合TP 抗原是經(jīng)過B細(xì)胞表位分析預(yù)測確定TP47，TP17 和TP15 的優(yōu)勢表位區(qū)段，并將其串聯(lián)融合表達(dá)為涵蓋三種抗原優(yōu)勢表位的嵌合抗原，既保持了抗原的大部分活性表位，又去除了TP47 中和人纖連蛋白存在較高同源性的區(qū)段。本研究基于此抗原所建立的干式熒光發(fā)光法TP 總抗體快速檢測技術(shù)檢測國家參考品，陽性參考品、陰性參考品、最低檢出限和重復(fù)性檢測結(jié)果均符合要求。在臨床性能評價中，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，ROC 曲線分析顯示本研究技術(shù)具有較高檢測性能，但特異度有待進(jìn)一步提高。

本研究的干式熒光發(fā)光法TP 總抗體快速檢測技術(shù)基于免疫層析和熒光發(fā)光平臺，采用雙抗原夾心法原理設(shè)計。將該檢測技術(shù)與臨床廣泛使用的酶聯(lián)免疫法檢測試劑相比較，具有高等效性。但是本研究檢測技術(shù)僅需一步檢測，可在15 min 內(nèi)獲得結(jié)果，簡便快捷，檢測時間顯著縮短，更加適合術(shù)前快速檢測的要求。與膠體金免疫層析技術(shù)相比，敏感度更高，熒光信號通過設(shè)備讀取，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性、客觀性，容易進(jìn)行實驗室質(zhì)控，避免了人為判斷的誤差[15]。因此，本研究檢測技術(shù)是一種敏感度和特異度均高的現(xiàn)場快速簡便的檢測方法，能夠滿足臨床檢測需要。