兒童支氣管哮喘患者血清NETs和IL-4水平表達(dá)與發(fā)作期中醫(yī)證型的相關(guān)性分析

楊 怡，王永清，李 華（湖南中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬第一醫(yī)院兒科，湖南株洲 412000）

支氣管哮喘作為臨床常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，具有進(jìn)展慢、反復(fù)發(fā)作等特征[1]。支氣管哮喘在中醫(yī)屬“哮病”范疇，是脾肺腎等臟器功能先天不足、宿痰隱伏于肺引發(fā)[2]。因此，中醫(yī)認(rèn)為脾虛、腎虛是支氣管哮喘發(fā)生的主要影響因素[3]。中醫(yī)將哮喘分為實(shí)喘和虛喘，其中實(shí)喘包括寒喘、熱喘，虛喘包括脾虛、腎虛等[4]。研究表明，中醫(yī)辨證對(duì)支氣管哮喘發(fā)作期患者病情控制有重要意義，辨證治療可明顯提高療效[5]。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）是由組蛋白、DNA，抗菌肽及蛋白酶等組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[6]。有研究證實(shí)，DNA/NETs 可能通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)激活等促進(jìn)支氣管哮喘進(jìn)展[7]。白介素-4（interleukin-4，IL-4）在支氣管哮喘患兒血清中表達(dá)水平上調(diào)，可作為炎癥指標(biāo)，評(píng)估病情嚴(yán)重程度[8]。由于有研究證實(shí)，不同中醫(yī)辯證分型可能與免疫功能及炎癥反應(yīng)有關(guān)，因此本研究通過(guò)檢測(cè)支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清NETs 和IL-4 水平，分析二者與支氣管哮喘不同中醫(yī)證型間關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月～2020年1月本院收治的支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒98 例作為觀(guān)察組，其中男性63 例、女性35 例，年齡3～14 歲，平均6.62±1.57 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①西醫(yī)診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)關(guān)于兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；②均處于急性發(fā)作期；③中醫(yī)診斷符合《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[10]，包括熱喘證、寒喘證和虛喘證；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)心、腎、肝臟等重要臟器嚴(yán)重不足者；②并發(fā)惡性腫瘤者；③并發(fā)精神疾病、傳染性疾病者；④并發(fā)自身免疫性疾病者。入組患兒根據(jù)中醫(yī)證型分為熱喘證組37例，寒喘證組28 例和虛喘證組33 例。另選取同期在本院體檢的25 例健康兒童作為健康對(duì)照組，其中男性16 例，女性9 例，年齡3～14 歲，平均年齡6.57±1.61 歲。本研究入組受試兒童家屬均已簽署知情同意書(shū)，且本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。熱喘證組、寒喘證組、虛喘證組及健康對(duì)照組性別比例、年齡、病程、出生時(shí)體重比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組一般資料比較（±s）

表1 各組一般資料比較（±s）

項(xiàng) 目 熱喘證組（n=37） 寒喘證組（n=28） 虛喘證組（n=33） 健康對(duì)照組（n=25） χ2/F P性別 (男/女) 23/14 18/10 22/11 16/9 0.155 0.985年齡 (歲) 6.76±1.64 6.53±1.59 6.61±1.52 6.57±1.61 0.133 0.940病程 (月) 16.91±5.26 16.59±5.34 16.28±5.18 —— 0.125 0.882出生時(shí)體重 (kg) 3.64±0.81 3.82±0.78 3.54±0.75 3.79±0.82 0.831 0.479

1.2 儀器與試劑 收集受試兒童性別、出生時(shí)體重及入院或體檢時(shí)年齡、病程、外周血中性粒細(xì)胞水平、淋巴細(xì)胞水平、單核細(xì)胞水平等臨床資料。使用肺功能儀（型號(hào)：Master Screen，德國(guó)Jager公司）檢測(cè)肺功能指標(biāo)第1 秒用力呼氣量（forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1）占預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%），F(xiàn)EV1/用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）。

1.3 方法 使用PicoGreen 熒光染料及單管型多功能檢測(cè)儀（型號(hào)：ModulusTM，北京原平皓生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)血清游離DNA（cell-free DNA，cf-DNA）/NETs 水平。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算cf-DNA/NETs 水平。采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 檢測(cè)血清IL-4 表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，總體有差異進(jìn)一步通過(guò)SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例（百分比）即n（%）形式表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)。采用Pearson 法分析支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平與中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及肺功能指標(biāo)FEV1%，F(xiàn)EV1/FVC 水平相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 不同中醫(yī)證型患兒及健康兒童血清cf-DNA/NETs 及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞水平比較 見(jiàn)表2。單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)所示，健康對(duì)照組、虛喘證組、寒喘證組和熱喘證組患兒血清cf-DNA/NETs 及外周血中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞水平依次升高，淋巴細(xì)胞水平依次降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 不同中醫(yī)證型患兒及健康兒童血清cf-DNA/NETs 及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞水平比較（±s）

表2 不同中醫(yī)證型患兒及健康兒童血清cf-DNA/NETs 及中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞水平比較（±s）

注：與健康對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與虛喘證組比較，bP ＜0.05；與寒喘證組比較，cP ＜0.05。

項(xiàng) 目 熱喘證組（n=37） 寒喘證組（n=28） 虛喘證組（n=33） 健康對(duì)照組（n=25） χ2/F P cf-DNA/NETs（ng/ml） 1 023.51±100.52abc 845.38±83.29ab 694.05±75.93a 2.56±0.75 895.500 0.000中性粒細(xì)胞（×109/L） 79.04±5.27abc 71.95±5.46ab 65.49±5.76a 60.81±5.92 63.250 0.000淋巴細(xì)胞（%） 17.34±5.75abc 22.16±5.84ab 30.19±6.02a 35.03±6.38 53.900 0.000單核細(xì)胞（%） 8.73±1.23abc 7.52±1.19ab 5.96±1.25a 5.02±1.51 50.590 0.000

2.2 不同中醫(yī)證型患兒及健康兒童血清IL-4 表達(dá)水平 單因素方差分析四組血清IL-4 表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.585，P=0.000）。SNK-q檢驗(yàn)顯示，與健康對(duì)照組（17.31±1.85ng/L）比較，熱喘證組（23.54±1.82ng/L）、寒喘證組（21.69±1.76ng/L）、虛喘證組（18.97±1.94ng/L）患兒血清IL-4 表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清cf-DNA/NETs 與IL-4 水平相關(guān)性 見(jiàn)圖1。Pearson 法分析，支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清cf-DNA/NETs 與IL-4 水平呈正相關(guān)（r=0.431，P=0.000）。

圖1 支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清cf-DNA/NETs 與 IL-4 水平相關(guān)性

2.4 不同中醫(yī)證型患兒及健康兒童肺功能指標(biāo)水平比較 見(jiàn)表3。單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)所示，健康對(duì)照組、虛喘證組、寒喘證組、熱喘證組FEV1%，F(xiàn)EV1/FVC 水平均依次降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表3 不同中醫(yī)證型患兒及健康兒童肺功能 指標(biāo)水平比較（±s，%）

表3 不同中醫(yī)證型患兒及健康兒童肺功能 指標(biāo)水平比較（±s，%）

注：與健康對(duì)照組比較，aP ＜0.05；與虛喘證組比較，bP ＜0.05；與寒喘證組比較，cP ＜0.05。

組別 n FEV1/% FEV1/FVC/%熱喘證組 37 42.07±10.51abc 55.08±8.65abc寒喘證組 28 54.82±14.83ab 64.54±8.72ab虛喘證組 33 68.19±16.05a 78.03±8.95健康對(duì)照組 25 95.97±17.65 85.69±8.57 χ2/F — 71.410 75.790 P—0.000 0.000

2.5 支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平與中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及肺功能指標(biāo)水平相關(guān)性 見(jiàn)表4。Pearson 法分析顯示，支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平與中性粒細(xì)胞水平、單核細(xì)胞水平呈正相關(guān)（均P＜0.05），與淋巴細(xì)胞，F(xiàn)EV1%，F(xiàn)EV1/FVC 水平呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）。

表4 支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清cf-DNA/NETs，IL-4水平與中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及肺功能指標(biāo)水平相關(guān)性

3 討論

支氣管哮喘屬于慢性氣道炎癥性疾病，患者臨床表現(xiàn)為胸悶、喘息、氣促、咳嗽等反復(fù)發(fā)作，且多于清晨、夜間發(fā)作或加劇[11]。支氣管哮喘若進(jìn)展至急性發(fā)作期，會(huì)導(dǎo)致患兒出現(xiàn)呼吸困難并影響患兒生存[12-13]。中醫(yī)學(xué)中“哮病”即為支氣管哮喘，是宿痰內(nèi)伏于肺，外加飲食、勞倦等誘因引觸，致痰阻于氣道、肺氣上逆且出入為艱[14]。中醫(yī)辯證分型能夠從不同角度分析支氣管哮喘患兒癥狀，有利于病情控制。

中性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞分泌炎性因子，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)增加和氣道高反應(yīng)是支氣管哮喘急性發(fā)作的主要機(jī)制之一[15-16]。NETs 是一種以DNA 為骨架，另包括彈性蛋白酶、組蛋白等重要蛋白組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[17]。NETs 可被真菌、細(xì)菌、病毒等多種微生物激活，由中性粒細(xì)胞分泌并釋放到胞外，可消滅病原菌，并介導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激等[18-19]。研究表明，支氣管哮喘患兒外周血中cf-DNA/NETs 水平明顯高于健康兒童[20]。本研究結(jié)果顯示，入組支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒血清cf-DNA/NETs 水平明顯升高，與陳凱宇等[20]研究結(jié)果相似，表明cf-DNA/NETs 可能通過(guò)反映機(jī)體免疫炎癥損傷程度預(yù)示支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展。

IL-4 主要由活化Th2 細(xì)胞分泌，可誘導(dǎo)人B 細(xì)胞分化，是反映Th2 細(xì)胞功能的標(biāo)志物。研究表明，支氣管哮喘患兒血清IL-4 表達(dá)水平明顯上調(diào)，與機(jī)體免疫反應(yīng)激活及炎癥反應(yīng)增加有關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，熱喘證組、寒喘證組、虛喘證組患兒血清IL-4表達(dá)水平均明顯升高，與CUI等[22]研究結(jié)果相似，提示IL-4 可能通過(guò)誘導(dǎo)B 細(xì)胞生成IgE 和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子表達(dá)，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的選擇性聚集，最終導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)加劇。

本研究還發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘發(fā)作期患兒血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平與中性粒細(xì)胞水平、單核細(xì)胞水平呈正相關(guān)，與淋巴細(xì)胞、FEV1%及FEV1/FVC 水平呈負(fù)相關(guān)，表明血清cf-DNA/NETs 水平升高可能受中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞水平調(diào)控，通過(guò)參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，影響機(jī)體肺功能。

研究報(bào)道，支氣管哮喘的急性發(fā)作期在中醫(yī)證候分型中出現(xiàn)較多的有熱喘、寒喘、虛喘等，其中熱喘為痰熱壅肺、寒喘為風(fēng)寒襲肺、虛喘為肺腎兩虛[14]。熱喘證患兒痰鳴如吼、口渴喜飲、舌苔黃膩、弦滑等實(shí)熱征象較為明顯，熱喘證患兒血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平最高表明該組患兒炎癥反應(yīng)水平也最高，可能與陽(yáng)盛邪實(shí)有關(guān)；寒喘證患兒表現(xiàn)為喘憋氣逆、寒飲伏肺等征象，其陽(yáng)盛邪實(shí)相比于熱喘證患兒較弱；而虛喘證患兒主要是肺氣虛累、陽(yáng)氣虛損導(dǎo)致機(jī)體抵抗邪氣能力減弱，因此與炎癥反應(yīng)關(guān)系較其它兩種弱。

綜上所述，支氣管哮喘患兒血清cf-DNA/NETs，IL-4 水平明顯升高，且熱喘證患兒血清中二者水平最高，其次為寒喘證、虛喘證，二者水平變化可能與不同中醫(yī)證型存在一定相關(guān)性。但由于本研究不同中醫(yī)證型納入樣本量較少，兩因子對(duì)不同中醫(yī)證型評(píng)估價(jià)值尚需進(jìn)一步探究。