先天性肺氣道畸形患兒病變組織中差異表達基因的篩選及生物學功能分析

張剛，劉丹丹，蔡純，李瀟，曾慧儀，婁蕾，閆憲剛，俞鋼

1廣州醫科大學附屬第三醫院小兒外科，廣州510150；2廣州醫科大學附屬第三醫院超聲醫學科

先天性肺氣道畸形（CPAM）在先天性呼吸系統畸形中最常見，占比30%～40%，患病率占出生活胎的1/35 000～1/7 200［1］，近年來呈明顯上升態勢，這與CPAM產前診斷技術的進步有一定關系［2］。當前，多數患兒可在孕18～22周時通過產前超聲篩查被發現，敏感度達94%，特異度達95.3%［2］。CPAM的發病機制目前尚不明確，可能是由于胚胎發育過程中肺部上皮細胞與下層間充質細胞之間的信號傳導障礙，導致病變中缺乏正常的肺泡，進而形成以終末細支氣管過度增生與擴張為特征的錯構瘤樣病變。研究［2-4］顯示，肺胚胎發育涉及多種生長因子、轉錄因子和信號分子在上皮—間充質的相互作用，以及信號調控分子在肺上皮細胞和間充質細胞之間的相互作用。當前，二代測序技術所得數據穩定可靠，價格相對低廉，已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域。此技術可快速獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態下幾乎所有轉錄本的序列信息，進行疾病與正常樣本間的基因表達差異分析、可變剪切和融合基因分析，進而尋找致病基因、探索發病機制。相對于傳統基因芯片而言，二代測序技術無需預先設計特異性探針，具有檢測范圍廣、準確率及分辨率高等優點［5］。本研究利用二代測序技術結合生物信息學分析，篩選了CPAM患兒病變組織中的差異表達基因，并對差異表達基因進行生物信息學分析，為深入研究CPAM的發病機制提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取廣州醫科大學附屬第三醫院小兒外科2020年1—3月收治的CPAM患兒5例。納入標準：①產前檢查、術前CT檢查、術中診斷、術后病理檢查均確定為1型CPAM；②患兒年齡0.5～1歲，病灶直徑5～10 cm，無胎兒水腫、術前無感染、未接受化療和放射治療、無合并明確的染色體畸形等情況；③患兒接受胸腔鏡微創手術治療，術后未留置胸管，無感染、出血、再手術等，隨診1年未見存留、復發、再發、繼發感染、氣胸等；④患兒監護人均簽署知情同意書并支持本研究。5例患兒術中分別留取CPAM病變組織、CPAM病變旁組織（直徑5 mm）各1份，共計10個樣本，分別標記為1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、5b，樣本置于液氮中冷凍后迅速轉移至-80℃冰箱中保存。

1.2 CPAM患兒病變組織中差異表達基因的篩選

1.2.1 受檢樣本RNA-Seq文庫的構建 采用TRIzol法對樣本總RNA進行抽提，抽提所得的總RNA取樣分別進行濃度、28S/18S或23S/16S、RIN值質檢，質檢合格后，使用Total RNA-seq（H/M/R）Library Prep Kit for Illumina?構建文庫：先將設計好的DNA探針與RNA樣品進行雜交，從而將rRNA從總RNA中去除；隨后將RNA進行片段化，合成cDNA第一鏈，采用鏈特異的方法，在第二鏈cDNA合成時摻入dUTP對其進行標記，同時在此步完成末端修復；接著進行加A-尾、連接接頭、連接產物純化和片段大小分選、文庫擴增等步驟，在PCR擴增前用UDG酶消化帶dUTP的第二鏈模板，PCR擴增結束后用磁珠純化回收，即得RNA-Seq文庫。

1.2.2 RNA-Seq文庫質量評估 文庫構建完成后，先使用Qubit 3.0進行初步定量，隨后使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫進行檢測，插入的目的片段大小符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫有效濃度>3 nM），以保證文庫質量［5］。

1.2.3 RNA-Seq文庫的測序 文庫質量評估合格后，將不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求測序（測序平臺：Novaseq 6000 PE150，美國Illumina?公司），測序數據量為10 G：對原始序列進行過濾，去除接頭序列、含N較多的序列及低質量的序列，獲得待分析序列，用Fast QC軟件對其進行質量評估［6］。通過與核糖體數據庫進行比對，去除核糖體RNA序列，用RSEM軟件［7］獲得基因的表達序列數。只有表達豐度足夠高的基因才是具有生物學意義的差異表達基因，反應真實的生物學現象，因此，需要對基因的表達進行了過濾。過濾標準為：基因的表達值（CPM值）至少在一半樣本中都大于1才被保留。然后，使用M-值的加權截尾均值法（TMM）對不同樣本每個基因的表達進行標準化，獲得有效序列。

1.2.4 異常樣本剔除 利用主成分分析來考察樣品中是否存在異常樣品：通常組內的樣本會聚類在一起，組間的樣本會分隔開，異常樣本則會和本組內樣本分隔開。選擇兩個主成分因子：分別從序列差異性最大PC1（63.6%）和次大PC2（13.4%）兩個方向提取，制作主成分分析圖。如果檢測到異常樣本，在差異分析時，該樣本應該被排除在外。

1.2.5 CPAM病變組織與CPAM病變旁組織差異表達基因的提取與篩選 剔除異常表達的樣本后，使用edgeR軟件將有效序列與參考基因組進行比對、序列預測、表達值計算，設置差異倍數foldchange=1.5、P<0.05、FDR<1，篩選出CPAM病變組織與CPAM病變旁組織的差異表達基因［8］。1.3 差異表達基因的基因本體（GO）功能富集分析和KEGG信號通路分析 使用R軟件cluster Profiler對差異表達基因進行分析［9］：通過計算差異表達基因與GO集合的交集獲得統計學顯著性（超幾何檢驗，P=0.05）來判斷目標基因集合是否能發揮某種功能，包括差異表達基因參與的生物學過程、細胞組成以及分子功能三個層面，取P<0.05且P值最顯著的前10個結果。利用cluster Profiler在線網站對篩選的差異基因注釋到最新的KEGG信號通路進行分析，按照P<0.05篩選出排名前10的信號通路。

2 結果

成功構建10個樣本的RNA-Seq文庫，文庫質量合格，各樣本序列數見表1。

表1 各樣本序列數（個）

2.1 CPAM病變組織與CPAM病變旁組織差異表達基因的篩選結果 依據主成分分析結果，剔除異常表達的樣本3b后，共篩選出CPAM病變組織與CPAM病變旁組織差異表達基因1 063個，其中上調的基因860個、下調的基因203個。上調的基因包括FOXJ1、Sox2、BMP8A、BMPR1B、DNAAF4、LRP2、MNS1、WT1、CRISP3、SCGB1A1、FCGBP、MSMB、SLC5A5、SPINK1、KRT17、CLCA2、UPK1B、UGT1A6、VTCN1、B3GNT3、ERN2、CCNO、KRT15、CXCL13、SPATS1、KRT5、MUC4、RHOV、RPL13AP17、MUC16、CYP2F1、SRD5A2、TMEM130、KLK13、PLEKHS1、EPN3、CDC20B、C1orf141、CCL11、RUNDC3B、SPP1、SPATA4、FUT2、TCP11X2、ANKRD66、CRISP2、CP、C12orf74、PROM1、PRR18等，下調的基因包括BMP6、BMPR2、BMPER、HBA1、Smad6、Smad7、LPL、CD52、TNFSF10、CD109、NAGS、NRG3、RAMP2、GPER1、FPR2、GBP1、C1QTNF5、WNT2B、CORO6、MFAP3L、BMPR2、EHD3、RSAD2、CRMP1、LILRA1、BMPER、MASP1、SEMA6A、DSC2、SLC16A6、ACSS3、ADAMTS7、CHRD、ZNF331、WNT2、EXOC3L1、GRIA1、ACVRL1、SMAD7、AATBC、TAL1、LOC400685、CCDC68、ABCA3、COL4A2、B3GNT8、MS4A14、DPEP2、LIN7A、GBP4、ITGA1等。

2.2 差異表達基因的GO功能富集分析和KEGG信號通路分析結果 GO功能富集分析結果顯示，差異表達基因的細胞組成主要位于軸絲、纖毛質、活動纖毛、微管、微管相關復合物、細胞頂端部分、含膠原的細胞外基質、神經元細胞體、纖毛基體等，參與的分子功能主要有微管蛋白結合功能、受體配體活性、信號受體激活劑活性、內肽酶活性、ATP酶活性、肌動活性、微管結合功能、G蛋白耦聯受體結合功能、微管運動活性、絲氨酸型肽酶活性等，涉及的生物學過程主要有纖毛組織、纖毛組裝、基于微管的運動、纖毛運動、微管束形成、多細胞機體穩態、纖毛或鞭毛依賴性細胞運動、纖毛依賴性細胞運動、軸絲組裝、鞭毛運動等。KEGG信號通路分析結果顯示，差異表達基因參與了PI3K-Akt信號通路、血管平滑肌收縮、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、神經活性配體—受體相互作用、細胞因子—受體相互作用、亨廷頓病、轉錄失調、黏著斑、ECM-受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子—受體相互作用、蛋白質消化吸收等信號通路的調控。

3 討論

CPAM根據病理表現分為5型：0型表現為先天性肺泡發育不良，實性外觀，肺縮小變硬，占1%～3%；1型由1個以上囊腫組成，壁厚，囊腫直徑2～10 cm，占60%～70%；2型多個小囊組成，囊腫直徑0.5～2 cm，占10%～15%；3型由蜂窩狀微囊組成，囊腫直徑<0.5 cm，約占5%；4型多為單個或分隔大囊，囊腫直徑>10 cm，約占28%。本研究為保證樣本量充足、研究結果的普惠性，選取發病率最高的1型CPAM樣本為研究對象。

CPAM的病因尚無統一認識，當前主要有2種假說［10］。其一為支氣管梗阻假說：STOCKER等［11］于1977年提出，MOERMAN等［12］所做的尸檢為該假說提供了解剖證據，認為支氣管功能性或器質性阻塞導致了肺發育過程中細胞增生和凋亡異常。其二為環境假說：基因缺陷或微環境變化導致調控因子異常表達而致使肺發育異常。肺發育的5個組織學階段中，內胚層上皮細胞和間充質細胞的分子表達及信號通路起到關鍵作用［13］，例如前腸腹側上皮細胞的甲狀腺轉錄因子（TTF1）的編碼基因Nkx2-1、前腸背側的性別決定區基因Y-box2、Sox2、Hoxb-5等；而BMPs和它的拮抗因子Noggin、FGF10、Wnt等則在間充質細胞內起作用［1］。當上皮細胞與間充質細胞之間的信號傳導異常時，則導致肺實質內肺泡形成障礙，終末細支氣管過度增生、擴張，形成單房、多房或蜂窩狀錯構瘤樣的CPAM［1］。

本研究中，我們利用二代測序技術順利得到了10個樣本序列，質量均合格，順利構建RNA-Seq文庫。在做樣本主成分分析時，發現樣本3b和其他組內樣品分隔開，為了順利進行差異分析，該樣品被排除在外。本研究共篩選出860個上調的基因和203個下調的基因，可見CPAM的發生與多個基因的上調和下調有關［1，13-15］。為明確上述差異表達基因集合的功能，我們采用R軟件cluster Profiler與GO集合進行功能富集分析［9］，包括分子功能、生物學過程和細胞組分三個部分。基因或蛋白質可以通過ID對應或者序列注釋的方法找到與之對應的GO號，而GO號可對應到隊列ID，即功能類別或者細胞定位。在GO功能富集分析結果中發現，細胞組分主要有軸絲、纖毛、微管、細胞頂端部分等，分子功能主要有微管蛋白結合、受體配體活性、信號受體激活、ATP酶活性、肌動活性、微管結合功能、G蛋白耦聯受體結合、微管運動活性等，生物過程主要有纖毛組織、纖毛組裝、軸絲組裝、微管束形成、纖毛及鞭毛運動等。KEGG信號通路分析結果顯示，差異表達基因參與介導了PI3K-Akt信號通路、血管平滑肌收縮、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、神經活性配體-受體相互作用、細胞因子-受體相互作用、亨廷頓病、轉錄失調、黏著斑、ECM-受體相互作用、病毒蛋白與細胞因子-受體相互作用、蛋白質消化吸收等多條信號通路，均涉及肺發育過程中的細胞增殖、遷移以及凋亡。通過GO功能富集分析和KEGG信號通路分析可預測CPAM的病理生理過程與纖毛及初級纖毛的形成、退化有關。

本研究基于二代高通量測序技術構建了穩定可靠的CPAM患兒RNA-Seq文庫，篩選出差異表達基因1 063個：上調的基因860個，下調的基因203個。通過GO功能富集發現差異表達基因與纖毛形成、退化有關，KEGG信號通路分析提示差異表達基因參與了多個肺發育過程相關的信號通路。通過上述方法，初步明確各個基因的功能類別及細胞定位，預測了CPAM可能的發病機制。可見，生物信息學分析為研究CPAM轉錄調控網絡及篩選分子生物學標志物提供了有效手段［21］。

（收稿日期：2021-06-23）