西格列汀對NOD小鼠甲狀腺基因表達的影響*

趙云娟，謝云亮，何欣燃，陳旖鹛，李萬根

（廣州醫科大學附屬第二醫院1.內分泌科；2.體檢中心，廣東 廣州 510260）

自身免疫性疾病包括對一系列對自身抗原的免疫反應導致靶器官損傷或功能障礙的慢性疾病。各種自身免疫性疾病具有某些共同的遺傳因素和免疫過程，這些疾病往往共存于同一個人或家庭［1］。1 型糖尿病是由T 細胞介導的胰島β 細胞破壞導致胰島素分泌缺乏，最終導致高血糖的慢性自身免疫性疾病。甲狀腺是最容易受自身免疫性疾病影響的器官。在80 余種不同的自身免疫性疾病中，腸道疾病和甲狀腺功能減退是1 型糖尿病最常合并的自身免疫性疾?。?-3］。芬蘭的一項全國性研究顯示1 型糖尿病的患者中有五分之一患有另一種自身免疫性疾病［4］。一項為期13 年的臨床隨訪研究發現，在1 型糖尿病患者中，自身免疫性甲狀腺炎的患病率更高［5］。并發自身免疫性甲狀腺炎可使兒童非復雜性1 型糖尿病患者的皮膚微循環功能顯著惡化，且這一過程與患者年齡、糖尿病病程和發病年齡無關［6］。同樣，自身免疫性甲狀腺炎患兒中，1 型糖尿病自身抗體流行率和新診1 型糖尿病發病率顯著高于普通兒童，提示兒童自身免疫性甲狀腺炎患1 型糖尿病的風險增加［7］。提示1 型糖尿病和甲狀腺自身免疫異常可能存在相互作用。

本研究前期的研究發現二肽基肽酶4（DPP-4）抑制劑（西格列汀）能延緩成人隱匿性自身免疫糖尿病患者胰島β 細胞功能的衰竭［8］。長期西格列汀干預可減輕1 型糖尿病NOD 小鼠胰島炎癥浸潤，同時下調血清白細胞介素（IL）-1β 及IL-12水平［9］。DPP-4 抑制劑對1 型糖尿病NOD 小鼠胰島β 細胞自身免疫破壞的保護作用與CD8+T 效應記憶亞群的改變相關［10］，還可增加調節性T 細胞數目［11］。體外試驗顯示西格列汀抑制人淋巴細胞增殖和Th1/Th17 細胞分化［12］。DPP-4 抑制劑通過抗感染作用減輕1 型糖尿病動物腎臟損傷［13-14］。利格列?。硪环NDPP-4 抑制劑）上調基質細胞衍生因子對進展期糖尿病腎病起保護作用［15］。DPP-4 抑制劑可保護1 型糖尿病大鼠腸系膜動脈內皮功能［16］，提示DPP-4 抑制劑對1 型糖尿病胰腺以外的器官存在生物學作用。由于甲狀腺組織是1型糖尿病患者除了胰島外最容易受到免疫攻擊的靶器官，本研究將DPP-4 抑制劑干預和生理鹽水干預的NOD 小鼠的甲狀腺組織進行分離并純化，利用基因芯片技術篩選甲狀腺組織中的差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs），通過生物信息學方法進行聚類和功能富集分析，篩選出關鍵表達基因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

3 月齡雌性NOD/LtJ 小鼠6 只，購自南京大學動物模式研究所，動物合格證號：32002100000007，平均體重（24.4±1.7）g。所有動物飼養于廣州醫科大學實驗動物中心，動物飼養級別為SPF 級。NOD 小鼠以標準飼料分籠喂養，自由飲水及進食，飼養條件：12 h 光照周期，室溫維持在18～22℃，相對濕度40%～70%。所有有關動物操作均遵守廣州醫科大學相關動物倫理規定及條例。小鼠隨機分成兩組，實驗組采用DPP-4 抑制劑（西格列汀）灌胃，對照組采用等體積的生理鹽水灌胃。連續干預12 周，第13 周處死小鼠。DPP-4 抑制劑（西格列?。┵徸悦绹硸|公司。

1.2 研究方法

1.2.1 甲狀腺組織分離 頸椎脫臼法處死小鼠，解剖小鼠。小鼠仰臥位固定，充分暴露頸部，切開頸部皮膚，充分暴露皮下器官，看到淡粉色的甲狀腺組織，完整分離甲狀腺組織，放入凍存管，之后移至-80℃冰箱保存。

1.2.2 微陣列芯片雜交與數據分析 微陣列芯片雜交實驗委托北京博奧晶典生物技術有限公司完成。取DPP-4 抑制劑組和對照組NOD 小鼠甲狀腺組織，根據TRIzol 試劑盒說明書提取總RNA，然后純化，反轉錄成cDNA，體外轉錄合成cRNA，cRNA 反轉錄生成cDNA，純化、定量反轉錄產物，通過熒光標記后進行芯片雜交。雜交結束后，取出芯片進行芯片清洗及掃描，得到雜交圖片。使用Agilent Feature Extraction（v10.7）軟件對雜交圖片進行分析同時提取數據，最后采用Analyzer軟件進行分析。基因表達的差異用P值和差異倍數（fold change,FC）表示。篩選mRNA 表達差異倍數≥2，且P<0.05 為DEGs。對DEGs 進行GO（Gene Ontology）功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析。

1.3 統計學方法

統計學分析采用Graph Prism 8.0 軟件進行。計量資料以均數±標準差（）表示，組間兩兩比較采用t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 篩選出NOD 小鼠甲狀腺組織中差異表達的基因

NOD 小鼠甲狀腺組織表達譜芯片雜交掃描以后的tiff 格式圖片數據采用Feature Extraction 軟件進行預處理分析，后通過GeneSpring GX 軟件計算基因表達差異并計算P值。采用Cluster3.0 軟件進行Cluster 分析和圖形化展示。通過對DPP-4 抑制劑干預的NOD 小鼠及安慰劑干預的NOD 小鼠甲狀腺組織中的差異基因進行篩選，采用火山圖（圖1）和聚類熱圖（圖2）對結果進行分析。在初篩得到的差異基因中篩選服從mRNA 表達差異倍數≥2，且P<0.05，定義為差異基因，作為本次研究的目的基因。在實驗組（DPP-4 抑制劑組）和對照組中，篩選出有表達差異的基因475 個，其中包含290 個基因的表達顯著上調和185 個基因的表達顯著下調（差異≥2 倍）。聚類熱圖表示這些基因在DPP-4 抑制劑組和對照組中的表達情況。

圖1 DPP-4 抑制劑與安慰劑干預NOD 小鼠DEGs 的火山圖分析

圖2 安慰劑與DPP-4 抑制劑干預NOD 小鼠的差異基因的聚類熱圖

2.2 GO 富集分析

本研究采用clustersetup 3.0.exe 軟件進行GO功能分析，以P<0.05 為篩選標結果（圖3）顯示DEGs 主要富集于T 細胞分化、皮膚功能調節、神經系統突觸及突觸后功能、濃縮核染色體著絲點功能及泛素結合酶活性等生物功能密切相關。

圖3 DEGs 的GO 功能分析

2.3 KEGG 通路分析

筆者使用KEGG 對DEGs 進行了通路富集分析（圖4）。結果顯示這些基因主要富集在細胞周期后期促進復合物的轉換、磷酸化、激活及介導相關蛋白的降解，有絲分裂細胞周期調節，甲基化和花生四烯酸代謝通路。進一步分析顯示KEGG信號途徑顯著富集于花生四烯酸代謝、炎癥性腸病、代謝途徑、糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的生物合成、血管平滑肌收縮及Janus 激酶/信號轉導與轉錄激活因子（JAK/STAT）信號通路，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。通過對顯著富集的miRNA 進行分析，篩選出miR-568 等10 個顯著表達上調的基因和miR-686 等10 個顯著表達下調的基因，差異有統計學意義（P<0.05）（圖5）。

表1 mRNA 的KEGG 通路顯著富集的條目（term）

圖5 顯著富集的差異表達miRNA

3 討論

通過對DEGs 進行GO 功能分析和KEGG 通路分析，發現DEGs 參與花生四烯酸代謝、炎癥性腸病、代謝途徑、糖基磷脂酰肌醇錨定的生物合成、血管平滑肌收縮及JAK/STAT 信號通路。花生四烯酸可減輕鏈脲霉素誘導的RIN5 F 細胞毒性，同時減輕鏈脲霉素誘導的1 型糖尿病［17］?；ㄉ南┧峥赡苁莾仍葱缘目固悄虿》肿樱?8］。本研究顯示DPP-4 抑制劑干預NOD 小鼠甲狀腺組織，DEGs顯著富集于花生四烯酸代謝通路，而花生四烯酸可減輕1 型糖尿病，提示DPP-4 抑制劑可能通過影響花生四烯酸代謝起到減輕1 型糖尿病的作用，這可能是除了免疫調節減輕胰島炎以外的另一條旁路。花生四烯酸代謝產物在調節甲狀腺FRTL-5細胞ATP 誘導的鈣調節中起重要作用［19］。本研究顯示DPP-4 抑制劑對甲狀腺花生四烯酸代謝通路存在影響，提示DPP-4 抑制劑可能影響甲狀腺相關免疫及功能。

既往研究顯示短期使用DPP-4 抑制劑不會增加炎癥性腸病的風險［20］。一項納入198 404 例患者的meta 分析研究顯示：基于保守的隨機效應分析，DPP-4 抑制劑不會增加炎癥性腸病的風險［21］。另一項納入13 個隨機對照臨床研究顯示使用DPP-4 抑制劑和炎癥性腸病之間沒有相關關系［22］。在實驗性結腸炎的動物模型中，阿格列汀能促進腸道粘膜損傷的恢復，從而加速愈合［23］。通過聯合抑制DPP-4 和丙氨酰氨肽酶N 可以通過誘發內源性自身免疫抑制機制對炎癥性腸病起到有效的治療作用［24］。本研究顯示DPP-4 抑制劑干預NOD小鼠甲狀腺差異基因表達富集于炎癥性腸病相關基因及通路，提示DPP-4 抑制劑干預可能與炎癥性腸病相關，有待進一步的研究證實。

糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol,GPI）在MDCK 細胞中起著頂端靶向信號的作用。GPI 錨定蛋白優先靶向于Fischer 大鼠甲狀腺上皮細胞基底的外側面［25］。GPI 可能在豬的甲狀腺細胞調控和膜信號系統中發揮作用［26］。GPI/肌醇磷酸聚糖（inositolphosphate glycan,IPG）是參與控制甲狀腺細胞增殖的胞內信號系統［27］。以上研究均提示GPI 信號在甲狀腺細胞增殖及功能調節中起重要作用，而本研究顯示DPP-4 抑制劑干預后甲狀腺基因表達改變顯著富集于GPI-錨定蛋白合成相關信號，提示DPP-4 抑制劑可能對甲狀腺細胞增殖及胞內信號調節等存在影響，值得下一步深入研究。對于長期使用DPP-4 抑制劑干預的患者，可進行甲狀腺功能及抗體水平監測。

西格列汀通過調節JAK/STAT 信號通路減輕實驗性糖尿病大鼠心肌?。?8］。西格列汀和托法替尼通過調節JAK/STAT 和TLR4/NF-κB 信號通路的交叉作用改善佐劑誘導的關節炎［29］。JAK/STAT 信號通路是調節T 細胞分化的關鍵信號通路。而本研究GO 富集分析顯示DPP-4 抑制劑干預對NOD 小鼠甲狀腺DEGs 富集于T 細胞分化。由此提示DPP-4 抑制劑可能通過JAK/STAT 信號參與T 細胞分化。既往研究顯示西格列汀體外抑制人淋巴細胞增殖及Th1/Th17 的分化［12］。DPP-4/CD26 高表達于T 細胞，尤其是CD4+T 細胞表面，并參與這些細胞分化、成熟和增殖調節。西格列汀干預12周顯著減少2 型糖尿病患者循環CD4+T 細胞，尤其是Th17 和Treg 細胞數目［30］。綜合上述，提示DPP-4 抑制劑可能參與T 細胞的分化、成熟、增殖和激活等環節。西格列汀通過激活Kv 通道和蛋白激酶a 誘導血管舒張［31］。利格列汀聯合二甲雙胍通過AMPK/Nox4 信號通路對血管平滑肌重構存在潛在保護作用，從而改善糖尿病大鼠新生內膜增生［32］。本研究顯示DPP-4 抑制劑干預對NOD 小鼠甲狀腺組織的血管平滑肌收縮相關基因存在影響，有待進一步研究證實。

小RNA（miRNA）在淋巴細胞的發展和功能中起重要作用。miRNA-568 的表達水平在T 細胞（包括Jurkat 細胞和人外周血CD4+T 細胞）激活過程中下降，而活化T 細胞核因子5（NFAT5），進一步的研究證實miRNA-568 通過靶向針對NFAT5抑制CD4+T 細胞的激活和功能［33］。本研究中，DPP-4 抑制劑干預顯著上調miRNA-568 表達水平，提示其可能對CD4+T 細胞的激活和功能存在抑制作用。miRNA-582-5p 通過抑制TGF-β 信號通路抑制前列腺癌骨轉移［34］。miRNA-582-5p 通過靶向AKT3 抑制胃癌細胞增殖［35］。miRNA-582-5p 通過下調NOTCH1 抑制非小細胞肺癌的生長和侵襲［36］。miRNA-582-5p 作為細胞遺傳學正常的中危性急性髓系白血病的抗腫瘤生物標志，可抑制白血病細胞的增殖并誘導白血病細胞凋亡［37］。本研究中DPP-4 抑制劑干預顯著上調miRNA-582-5p，提示其對腫瘤的生長、增殖和侵襲存在抑制作用，提示DPP-4 抑制劑在腫瘤治療方面的潛在價值。

長鏈非編碼RNA Gm15575 能阻斷miRNA-686的功能，正向調控Th17 細胞中高表達的促炎趨化因子CCL7 的表達和Th17 的分化［38］。miRNA-743a介導氧化應激線粒體蘋果酸脫氫酶的上調，提示其可能在氧化應激和神經變性中起作用［39］。在體外miRNA-743a 介導的WT1 抑制可阻止腎間充質細胞的增殖［40］。本研究顯示DPP-4 抑制劑干預顯著下調miRNA-686 和miRNA-743a，提示其對Th17 分化、氧化應激和神經變性存在作用，有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過基因芯片技術篩選DPP-4 抑制劑干預NOD 小鼠及對照組小鼠甲狀腺組織的DEGs，并進一步行基因相關功能及通路分析，結果顯示DEGs 主要富集于花生四烯酸代謝等信號通路。生物學功能方面與T 細胞的分化密切相關，可能對1 型糖尿病患者的甲狀腺自身免疫功能存在影響。