針刀干預對膝骨關節炎兔股直肌纖維化的影響

劉 晶，曾維銓，林巧璇，盧莉銘，郭澤興，劉 洪，張良志，修忠標，4

1 福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建福州 350004；2 福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建福州 350003；3 福建中醫藥大學，福建福州 350122；4 中醫骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建福州350122

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）引起的疼痛及功能障礙嚴重影響著中老年患者的生活質量。針刀療法作為中醫原創技術，能有效調節骨骼肌功能，改善KOA 疼痛和功能障礙［1］。筆者所在團隊前期臨床研究也顯示，基于經筋理論針刀循膝周經筋病灶點松解能調整KOA 關節間隙，有效緩解疼痛和改善功能［2］，然而其作用機制尚不明確。骨骼肌慢性損傷后的愈合過程主要有炎癥、再生和纖維化3 個階段，結局是Ⅰ型膠原纖維（type Ⅰcollagen fibers，ColⅠ）、波形蛋白（vimentin，VIM）、α-肌動蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA）等細胞外基質的沉積，影響骨骼肌功能［3-4］。針刀治療KOA 的作用機制可能與調節骨骼肌慢性損傷纖維化有關，但目前還無相關報道。因此，本研究從股直肌纖維化的角度探討針刀治療KOA可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性6 月齡新西蘭大白兔24 只，體質量（2.0±0.5）kg，訂購于上海松聯實驗動物責任有限公司［生產許可證號碼：SCXK（滬）2017-0008］，委托福建省中醫藥研究院實驗動物中心［SYXK（閩）2016-0005］代購并飼養。實驗動物單籠喂養，飼養房溫度20～25 ℃，濕度30%～60%，自然光照，自由進食、飲水。適應性飼養1周后，按照體質量進行編號，并應用隨機數字表法將其分為空白組、模型組和針刀組，每組8只。本實驗已通過福建省中醫藥研究院動物實驗倫理委員會批準（FJATCM-IAEC2019037），整個實驗過程中對動物的各種處理均遵照中華人民共和國科技部2006 年頒布的有關動物的使用及倫理學規定。

1.2 主要試劑和儀器

Masson染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），ColⅠ、VIM、α-SMA、β-actin、GAPDH 抗體（北京博奧森生物技術有限公司），二抗（武漢三鷹生物技術有限公司），Trizol（美國Thermo公司），mRNA逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀），引物（上海生工生物工程股份有限公司），10%水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），4%多聚甲醛、10% EDTA、0.9%NaCl 注射液（南京丁貝生物有限公司）。一次性使用0.4 mm×40 mm 無菌小針刀（江西老宗醫醫療器械有限公司），DR 機（日本島津），3.0 T 高場強核磁共振（德國西門子），光學顯微鏡、自動脫水機、組織包埋機、Leica 2025 石蠟切片（德國Leica 公司），高分子石膏（陜西安信醫學技術開發有限公司），普通石膏（浦江健宇衛生材料有限公司），手術刀片及相關器械（上海醫療器械批發部有限公司），一次性包埋盒、包埋模具（上海源葉生物技術有限公司），黏附載玻片、蓋玻片（江蘇世泰實驗器材有限公司）。

1.3 KOA兔模型制備及評價

采用改良Videman 法［5］將兔子仰臥于固定架上，膝前放置石膏托，高分子石膏繃帶單層螺旋纏繞，保持膝關節伸直中立位0°，踝關節背曲60°，最后使用防啃咬繃帶環形纏繞高分子石膏表面。造模6周后Lequesne MG 膝關節級別評分增高，經X線和MRI 影像學檢測提示關節間隙變窄、軟骨面欠光滑，股直肌張力增高，髕上1～3 cm 股直肌周圍可觸及條索或硬節為模型成功。

1.4 干預方法

造模成功1 周后，針刀組依據《中國經筋學》［6］膝關節經筋病灶點命名及定位，根據兔的骨度分寸，選取治療點“鶴頂次”（足陽明經筋病灶點，股四頭肌肌腱髕骨正上緣附著處）、“髕外上”（足陽明經筋病灶點，股外側肌肌腱髕骨外上緣附著處）、“髕內上”（足陽明經筋病灶點，股內側肌肌腱髕骨內上緣附著處），在施術部位，用活力碘消毒3遍，然后鋪無菌洞巾，使治療點正對洞巾中間，術者戴好無菌手套，采用一次性使用0.4 mm×40 mm 無菌小針刀進行松解，刀口線垂直皮膚進針刀，針刀抵達病變處行提插刀法松解，范圍不超過0.5 cm，操作結束后用無菌干棉球在手術部位按壓1 min，見圖1。每7 d干預1 次，干預4 次。空白組和模型組只做同樣的抓取和固定，不予針刀治療。

圖1 針刀治療過程Figure 1 Operating processes of acupotomy

1.5 指標檢測及方法

1.5.1 Masson 染色 于針刀干預結束后1 周，麻醉下耳緣靜脈空氣栓塞處死，迅速解剖左側膝關節，行髕前正中切口，逐層分離至關節囊，用尖刀切斷股四頭肌在髕骨上緣附著處肌腱，分離股直肌，迅速取髕上1～3 cm 股直肌，用生理鹽水清洗、濾紙吸干后，投入4%多聚甲醛中固定24 h，固定后用流水沖洗標本4 h，脫水、包埋，以厚度5 μm 制備組織切片。將組織切片置于60 ℃烘箱中干燥30 min后，常規脫蠟至水；隨后用配置好的Weigert鐵蘇木素染色5 min；酸性乙醇分化液分化5 s，水洗，藍化液反藍5 min，蒸餾水沖洗，麗春紅酸性復紅液復紅5～10 min，弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液洗1～2 min，弱酸工作液水洗1 min，苯胺藍染色1～2 min，弱酸工作液水洗1 min。95%酒精、無水酒精、二甲苯透明，中性樹膠封固。顯微鏡下觀察并拍照，用Image J圖像分析軟件分析計算膠原容積分數。

1.5.2 RT-PCR 針刀干預結束1周后，取兔股直肌組織，在研缽中加入液氮快速研磨，裝入預冷的EP管，加入1 mL Trizol，吹打，室溫靜置5 min；提取總RNA，核酸紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度；取總RNA 3 μL進行反轉錄。采用MMLV-PCR 擴增試劑盒反轉錄二步法，cDNA 置于-20 ℃保存備用。PCR 反應體系中含標本體系3 μL，引物體系17 μL，總體系20 μL。引物由上海生工生物工程股份有限公司設計，引物序列：GAPDH，正向：TGGAATCC ACTGGCGTCTTCAC，反向：AGGATGCGTTGCTGAC AATCTTGA；ColⅠ，正向：AGGAACCAAGGGACCTA AG，反向：CCAGGGAAACCAGTCATAC；VIM，正向：TGGACATTGAGATCGCCACC，反向：GAGTGGGTG TCAACCAGAGG；α-SMA，正向：GTCAGGAATCCC GTGAAGCA，反向：CATTGTCACACACAAGGGCG。PCR 反應條件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，72 ℃30 s，共40個循環。用相對定量2-ΔΔCt法分析結果。

1.5.3 Western blot 組織裂解法提取兔股直肌組織總蛋白，BCA法測定蛋白含量后，SDS-PAGE 凝膠電泳，NC 膜轉印，一抗、二抗孵育，ECL 顯色曝光。Gel Doc 2000 凝膠成像系統成像，Quantity One 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 或GAPDH 作為內參照蛋白進行校準，采用目標蛋白條帶灰度值/βactin 或GAPDH 條帶灰度值來表示目的蛋白相對表達水平。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 3組兔股直肌Masson染色形態學比較

空白組可見整齊的被紅染的骨骼肌纖維；模型組可見骨骼肌纖維破壞，被大量藍染的膠原纖維包繞；針刀組可見骨骼肌纖維較為整齊，被少量藍染的膠原纖維包繞。與空白組比較，模型組股直肌膠原容積分數增加（P＜0.01）；與模型組比較，針刀組股直肌膠原容積分數減小（P＜0.01）。見圖2。

圖2 3組兔股直肌Masson染色形態學比較Figure 2 Comparison of Masson stain in rectus femoris tissue of three groups

2.2 3 組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA 表達比較

見表1。

表1 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA表達比較（）Table 1 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA mRNA expression in rectus femoris tissue of three groups（）

表1 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA表達比較（）Table 1 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA mRNA expression in rectus femoris tissue of three groups（）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。Notes:Compared with the blank group,1)P＜0.01.Compared with the model group,2)P＜0.01.

2.3 3 組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA 蛋白表達比較

見圖3和表2。

表2 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA蛋白表達的比較（）Table 2 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA protein expression in rectus femoris tissue of three groups（）

表2 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA蛋白表達的比較（）Table 2 Comparison of ColⅠ，VIM and α-SMA protein expression in rectus femoris tissue of three groups（）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。Notes:Compared with the blank group,1)P＜0.01.Compared with the model group,2)P＜0.01.

圖3 3組兔股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA蛋白條帶顯影Figure 3 Protein band development of ColⅠ,VIM and α-SMA in rectus femoris tissue of three groups

3 討論

近年來普遍認為骨骼肌慢性損傷引起的筋骨失衡是導致KOA 疼痛和功能障礙的重要機制［7-8］。研究表明異常姿勢、外傷等均可引起膝關節骨骼肌慢性損傷［9-10］。骨骼肌纖維化在慢性骨骼肌損傷中扮演重要角色，當骨骼肌損傷出現后，機體在自我修復過程中，肌衛星細胞會過早分化成熟，促進生肌祖細胞向纖維祖細胞轉化，導致ColⅠ、VIM、α-SMA 等細胞外基質沉淀，出現骨骼肌纖維化，影響骨骼肌功能［11］，該過程受到Wnt 通路、TGF-β 通路、CTGF通路等一系列復雜的調控［12］。

研究表明推拿、針刺等方法干預能夠促進骨骼肌纖維化的修復，但目前臨床缺乏治療KOA 慢性骨骼肌纖維化的有效手段［13-14］。

調節骨骼肌功能和恢復筋骨平衡是改善KOA疼痛及功能障礙的有效途徑［15-16］。中醫經筋理論深刻揭示了肌肉骨骼系統之間內在聯系，從力學角度闡釋KOA“橫絡痹阻、筋骨失衡”的核心病機。針對經筋病機及病候特點，總結了“以痛為腧”和“橫絡解結”的治療方法。針刀最主要的功效在于松解軟組織粘連、瘢痕，切割攣縮，疏通堵塞，調節力學平衡［17-18］。因此，基于經筋理論針刀對KOA 筋骨失衡模式下足三陽、足三陰經筋在膝部常見筋結點的松解，從而恢復筋骨平衡，達到“筋柔骨正，調筋治骨”的目的［19］，治療KOA 取得確切療效［20-21］。股四頭肌是伸膝裝置重要組成部分，KOA 發病與股四頭肌功能下降等密切相關，通過松解股四頭肌病灶點和加強肌力訓練，可有效緩解KOA 患者膝關節疼痛和功能障礙［22-23］。股直肌連接了髖關節和膝關節，當髖膝聯動功能失常、下肢力線失衡，股直肌將會更容易受累而發病［24］。因此，本研究探討基于經筋理論針刀松解股四頭肌經筋病灶點對股直肌病變的影響，以揭示針刀治療KOA可能的作用機制。

本項實驗通過復制KOA 兔模型發現股直肌纖維化明顯，基于經筋理論針刀松解股四頭肌經筋病灶點能下調KOA 股直肌ColⅠ、VIM、α-SMA mRNA和蛋白的表達，減輕股直肌纖維化程度。針刀促進KOA 股直肌纖維化修復較推拿、針刺等具有明顯的優勢：針刀具有“刀割”和“針刺”的雙重作用，一方面，針刀通過松解骨骼肌粘連、瘢痕、攣縮，疏通堵塞，改善局部血液循環和力學環境，有利于骨骼肌纖維的再生和膠原纖維的降解［25］；另一方面，針刀較強的刺激作用可能激活人體修復系統，能促進骨骼肌的修復，從而修復KOA 骨骼肌的功能，調節筋骨平衡［26］。