針刺對腦出血大鼠血紅素氧化酶1及炎性因子表達的影響

陳秋欣，孔 瑩，于婷婷，張 瑜，劉 鵬，張 鑫

1 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江哈爾濱 150040；2 黑龍江中醫藥大學，黑龍江哈爾濱 150001；3 黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江哈爾濱 150001；4 深圳市寶安中醫院（集團），廣東深圳518133

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是卒中的亞型之一，占全部卒中類型的15%～20%，其死亡率和病殘率較高［1-2］。隨著人口老齡化速度的加快，其發病率持續上升［3］。腦出血后多數患者遺留有運動、語言、感覺、吞咽功能的障礙，嚴重影響人們的生活質量。盡管近些年關于腦出血治療的臨床和實驗研究有所增加，但仍未找到有效的治療方法［4］。目前多項研究表明，血腫本身引起的機械性損傷、血腫分解產物的繼發性毒性及炎性損傷是腦出血最主要的病理、生理改變［5-10］。腦出血后血紅蛋白破入到腦局部引起繼發性血腦屏障破壞，局灶性水腫以及神經元和神經膠質細胞凋亡等［11］。同時，腦出血引起的氧化損傷可以繼續激活腦組織中炎癥反應，導致大量細胞因子和炎癥介質釋放。血紅素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）是一種抗氧化酶，在氧化應激發生時起到清除氧自由基片段的作用［12-13］。核轉錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）在腦出血炎性反應中起中心調控作用，多種炎性因子如白介素6（Interleukin-6，IL-6）、白介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等均為其下游因子，與神經細胞凋亡關系緊密［14］。

我們既往研究顯示，針刺百會透曲鬢穴可以抑制TLR-4、NF-κB 蛋白的表達，降低血腫組織中促炎因子TNF-α、IL-6 的含量，減輕腦出血后炎性損傷，改善大鼠神經功能缺損，發揮腦保護作用［15-17］。但從HO-1 與炎性因子角度討論針刺對腦出血的保護作用的研究較少。本實驗采用針刺百會透曲鬢穴干預腦出血大鼠，觀察針刺對血腫組織HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表達影響，探討針刺治療腦出血的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級雄性Wistar 大鼠，8 周齡，體質量（300±20）g［吉林大學白求恩醫學院動物實驗中心提供，動物許可證號SCXK（吉）2013-0004］。動物于人工控制條件下，溫度（22±3）℃、相對濕度（60±5）%、12/12明暗變化條件下飼養。實驗遵循科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2 主要試劑及儀器

HO-1多克隆抗體（bs-0827R-1，上海振譽生物科技有限公司，中國）；NF-κB兔多克隆抗體（BM3940，武漢博士德生物有限公司）；IL-1β 多克隆抗體（70-ab33591-200，杭州聯科生物技術股份有限公司，中國）；TGF-β 多克隆抗體（70-ab35829-050，杭州聯科生物技術股份有限公司，中國）；立體定位儀（ST-5ND-C，中國成都儀器廠）；電泳儀（DYY-7C，北京六一生物科技有限公司）。

1.3 造模方法

參照文獻［18］制作腦出血大鼠模型。將大鼠用1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定于立體定位儀上，備皮消毒，正中切口，骨膜剝離器剝離骨膜，暴露前囟及冠狀縫，取前囟點（Bregma 點）右旁開3.5 mm，后0.2 mm 定點，用牙科鉆鉆直徑為1.0 mm 的圓孔，深達硬腦膜表面，鼠尾酒精消毒，距尾端3 cm 處剪斷鼠尾，用微量注射器取血50 μL，將微量注射器固定于立體定位儀上，沿鉆孔進針約6 mm，將未肝素化的血液50 μL以20 μL/min速度推進尾殼核，留針約5 min，緩慢出針。留針期間酒精棉球包扎鼠尾斷端傷口，術后局部噴灑慶大霉素，用牙科水泥封閉顱骨傷口，縫合頭皮，局部皮膚采用碘酚消毒。假手術組動物接受類似模型組的各項手術操作，但不進行注血。造模完成至大鼠清醒后，采用Berderson 評分法［19］確定動物成功模型。評分1～3分的大鼠納入實驗。

1.4 分組及干預方法

將108 只大鼠按隨機數字表法分為假手術組、模型組、針刺組。每組按1、3、7 d時間點再分為3個亞組，每組各12 只。①假手術組：接受類似模型組的各項手術操作，但不進行注血制作。②模型組：僅接受腦出血模型制作，不進行任何干預。③針刺組：制作腦出血模型。造模后12 h 開始治療。參照《實驗針灸學》［20］選取大鼠百會穴、患側曲鬢穴，采取百會（頂骨正中）穴透刺曲鬢穴（右眶外緣與右外耳門連線的后2/3），手持針灸針（0.30 mm×25 mm，蘇州安迪）快速進針，并向右下方曲鬢穴透刺，進針深度20 mm，以100 r/min小幅度捻轉。每間隔5 min捻針1 次，每次持續捻轉5 min，共留針30 min，每日1次。

1.5 觀察指標及檢測方法

術后1、3、7 d，對各組大鼠進行神經行為學評價，各組取6 只大鼠行HE 染色檢測腦組織病理損傷，取6 只大鼠行Western blot 檢測腦組織HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β蛋白表達。

1.5.1 神經行為學評價 采用改良的神經功能缺損評分（modified Neurological Severity Score，mNSS）對3組大鼠的神經功能損傷進行檢測［21-22］。

1.5.2 HE 染色檢測腦組織病理損傷 灌注后，取注血中心點前后2 mm的大鼠腦組織，包埋，冠狀切片，厚4 μm，每隔2 mm連續切6個腦片，HE染色，光鏡下觀察病理損傷。

1.5.3 Western blot 檢測腦組織HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表達 從-80 ℃冰箱取各組的腦組織，將腦組織勻漿離心后取上清液，采用BCA 法測定蛋白量。30 μL 處理后的蛋白樣品采用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PACE）轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，以標準蛋白Maker 為參照，5%脫脂奶粉封閉，相應條帶分別加入HO-1（1∶500）、NF-κB（1∶1 000）、IL-1β（1∶500）、TGF-β（1∶500），4 ℃孵育過夜。顯色完成后，將硝酸纖維素膜移至蒸餾水中終止顯色。用濾紙將膜吸干，避光放置20 min 后，將膜置于掃描儀中掃描，用凝膠圖像處理系統（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值。

1.6 統計學方法

數據采用SPSS 22.0進行統計學處理，計量資料服從正態分布均以（）表示。各時間組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組mNSS評分比較

評分前所有大鼠mNSS 評分均為0 分。假手術組術后無明顯神經功能缺損表現。模型組大鼠于1 d時已表現出神經功能缺損癥狀，3 d和7 d時仍有明顯神經缺損癥狀；與模型組相比，針刺組各時間大鼠神經功能評分明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 3組mNSS評分比較（）Table 1 Comparison of mNSS scores of rats in three groups（）

表1 3組mNSS評分比較（）Table 1 Comparison of mNSS scores of rats in three groups（）

注：與假手術組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。Notes:Compared with the sham operation group,1)P＜0.01;compared with the model group,2)P＜0.01.

2.2 3組大鼠HE染色結果

1、3、7 d時間點，假手術組大鼠基底節區可見正常的神經細胞及膠質細胞。模型組大鼠在造模1 d后可見出血灶；術后3 d 出血灶增大，腦組織病理結構破壞明顯；術后7 d 可見血腫范圍減少。與模型組相比，各時間點針刺組出血灶范圍縮小，腦組織病理結構破壞程度降低。見圖1。

圖1 3組大鼠HE染色結果Figure 1 HE staining results of rats in three groups

2.3 3組大鼠腦組織HO-1蛋白表達比較

假手術組可見HO-1 弱陽性表達。模型組HO-1 蛋白表達增高，于3 d 時間點相對表達最多。與模型組相比，于3、7 d 時間點針刺組HO-1 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 3組大鼠腦組織HO-1 Western blot結果Figure 2 HO-1 Western blot results of brain tissue of rats in three groups

2.4 3 組大鼠腦組織NF-κB、TGF-β 和IL-1β 蛋白表達比較

假手術組均可見NF-κB、TGF-β 和IL-1β 弱陽性表達；各時間點模型組NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白表達明顯增高，于3 d 時間點相對表達最多；與模型組相比，針刺組在1、3、7 d 時間點NF-κB、TGF-β和IL-1β蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖3～5。

圖3 3組大鼠腦組織NF-κB Western blot結果Figure 3 NF-κB Western blot results of brain tissue of rats in three groups

圖4 3組大鼠腦組織TGF-β Western blot結果Figure 4 TGF-β Western blot results of brain tissue of rats in three groups

圖5 3組大鼠腦組織IL-1β Western blot結果Figure 5 IL-1β Western blot results of brain tissue of rats in three groups

3 討論

腦出血屬于中醫“中風”范疇，針灸治療中風在臨床應用多年，并取得較好的臨床療效［23］。一項Meta 分析表明針灸治療腦出血急性期療效肯定［24］。早在春秋戰國時期，已有扁鵲取穴三陽五會即百會穴用來治病的案例。古籍《乾坤生意》中對于中風病的治療無論是風邪入腑還是風邪入臟均選用百會穴治療。曲鬢穴，屬足少陽膽經。采用百會透刺曲鬢穴，這一穴區橫跨頂、額、顳3 區，此區內含督脈、足太陽膀胱經及足少陽膽經，其經絡調節可縱貫全身，主治中風、腦病、感覺不利等。臨床研究亦表明針刺百會透曲鬢穴能夠改善中風患者的神經功能缺損程度，提高臨床療效［25］。實驗研究也表明早期針刺能促進血管新生及神經再生，且較長針刺時間對腦出血后血腦屏障有正向保護作用，說明針刺能夠起到腦保護的作用［26-27］。

腦出血后腦損傷的病理生理機制十分復雜，目前主要分為原發性損害和繼發性損害。原發性損害是指血腫對局部腦組織破壞，繼發性損害是指腦出血后腦組織對血腫及其釋放的血酶、血紅蛋白等化學物質，進一步導致腦組織水腫、炎性反應以及細胞凋亡等［28-29］。腦出血后，大量血紅蛋白破入腦實質，血紅素作為血紅蛋白分解產物能夠產生氧自由基和氧化應激反應，介導神經元死亡［30］。

作為人體內血紅蛋白分解產物——血紅素分解的限速酶，HO-1 發揮著重要作用，諸多研究均已證實，通過不同藥物或途徑激活HO-1 的活性，均能使其炎癥損傷減輕，反之，抑制其活性則能夠加重神經損傷［31-32］。目前對于HO-1 在腦出血中作用仍存在爭議，WANG 等［33］實驗結果表明HO-1 在腦出血中同時發揮抗氧化和促氧化作用。腦出血后第1～7天HO-1表達的增加起到了保護作用，而7 d后HO-1 的過度表達則可加重神經功能損傷。另一項研究發現在腦出血早期即可觸發HO-1 的神經保護作用，可能與HO-1 誘導的Nrf2 和NF-κB 進入細胞核的調節有關［34］。亦有研究表明HO-1通過抑制炎癥因子的表達來抑制NF-κB 的活化［35］。由此可見，HO-1與NF-κB 及相關炎性因子存在緊密又復雜的關系。

多年來，炎性反應一直是腦出血的重要病理生理機制［36-37］，作為具有多種功能且廣泛存在的一種核轉錄因子，NF-κB 靜息狀態下無活性狀態，當機體受到如應激反應、炎癥、細胞因子等刺激后，NFκB 即可解除抑制而被活化釋放，迅速進入細胞核，啟動特異靶基因的轉錄。可將NF-κB 看作炎癥介質基因轉錄的啟動開關，能夠觸發多種細胞因子和黏附分子等的表達，如IL-1β、TNF-α、TGF-β、IL-6等［38-39］。多項動物實驗研究表明炎癥反應介質IL-1β、TGF-β與腦出血后繼發性腦損害密切相關［40-45］。

本實驗通過mNSS 評分法觀察到模型組腦出血大鼠各時間點（1、3、7 d）出現不同程度神經功能缺損癥狀，在術后第3 天時模型組大鼠神經缺損癥狀相對最重，評分最高。直至術后7 d大鼠神經功能缺損癥狀減輕。針刺組大鼠各時間點（1、3、7 d）神經功能評分與模型組相比明顯降低，說明針刺能夠降低腦出血大鼠神經功能評分，改善神經功能缺損表現。模型組造模1 d 后出現血腫，周圍組織破壞明顯，術后3 d 可見出血灶范圍增大，7 d 時出血灶減小，腦組織水腫減輕；針刺組大鼠在各時間點與模型組比較病變程度均有所減輕，說明針刺可以有效地減輕腦出血大鼠的腦組織病理炎性損傷。Western blot 結果可見模型組HO-1、NF-κB、IL-1β、TGF-β蛋白表達均不同程度增高，相比模型組而言，針刺組各時間點（1、3、7 d）HO-1 蛋白表達增高，與模型組相比差異有統計學意義，說明針刺可以促進HO-1的表達；而針刺組各時間點（1、3、7 d）NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表達明顯減少，與模型組相比差異有統計學意義，說明針刺能夠抑制NF-κB、IL-1β、TGF-β蛋白表達。

綜上，針刺百會透曲鬢穴可能通過上調HO-1的表達，抑制NF-κB、IL-1β、TGF-β 蛋白表達，降低病理炎癥損傷，改善神經功能缺損表現，發揮腦保護作用。但針刺如何通過HO-1調控NF-κB介導的信號通路及其下游因子表達，以及HO-1 在腦出血中具體發揮什么樣的作用，仍需要人們進一步的深入研究，以期為臨床改善腦出血患者的治療找到新的思路。