circ-ZNF609在腫瘤中的表達及作用機制

劉 浪，趙俞喬，關滄海，胡增濤，王健崗，姜興明

環狀RNA(circRNA)由前體RNA通過首尾反向剪切形成，具有高度保守性、穩定性和時空特異性等特點，根據來源可分為外顯子circRNA、內含子circRNA和外顯子-內含子circRNA[1-2]。與mRNA相比，circRNA缺少5' 帽子和3' 末端多聚核苷酸尾，這種結構使circRNA十分穩定[3]。circRNA參與機體多種病理生理調控過程,且在諸多惡性腫瘤中異常表達并調控腫瘤惡性生物學行為，成為近年研究熱點。circRNA鋅指蛋白609(circ-ZNF609)是已知能夠調控諸多腫瘤發生和發展的circRNA，本文就circ-ZNF609在腫瘤中的表達及作用機制綜述如下。

1 circ-ZNF609概述

circ-ZNF609在circbase中編號為hsa-circ-0000615，定位于人類15號染色體[4]。有研究證實circ-ZNF609在神經元和血管內皮細胞中高表達，參與缺血誘導的視網膜血管功能障礙和青光眼誘導的視網膜神經變性，特異性沉默circ-ZNF609能減少視網膜血管丟失,同時抑制病理血管生成[5-6]。circ-ZNF609可在肌肉形成過程中編碼蛋白并促進成肌細胞增殖[7]。circ-ZNF609在肝細胞癌、結直腸癌、胃癌和腎癌等腫瘤中均呈異常高表達，并且參與調控腫瘤的惡性生物學行為。

2 circ-ZNF609與腫瘤

2.1肺腺癌 肺腺癌是臨床常見的肺癌亞型，早期診斷困難和有效治療缺乏使其預后不盡如人意[8-9]。ZUO等[10]通過qRT-PCR檢測發現肺腺癌組織中circ-ZNF609表達明顯高于癌旁正常組織。CCK-8和流式細胞學檢測結果表明，轉染特異性siRNA外源性下調腫瘤細胞內circ-ZNF609表達后，肺腺癌細胞增殖能力明顯下降，更多的癌細胞被阻滯在G0和G1期，并且發生凋亡細胞占比明顯升高。生物信息學分析預測circ-ZNF609和miR-1224-3p以及miR-1224-3p和ets變體基因1(ETV1)存在靶向結合序列，隨后雙熒光素酶分析檢測進一步證實這一結果。此外，沉默circ-ZNF609或過表達miR-1224-3p均能部分抑制ETV1對肺腺癌的促進作用。總之，異常高表達的circ-ZNF609促進肺腺癌的發生發展是通過miR-1224-3p/ETV1軸實現的。

2.2肝細胞癌 肝細胞癌是常見的消化系統惡性腫瘤，病死率較高[11]。LIAO等[12]通過qRT-PCR檢測發現circ-ZNF609在肝細胞癌組織中表達水平明顯高于正常組織。對轉染siRNA-circ-ZNF609的肝細胞癌細胞進行Transwell小室和劃痕實驗，結果顯示外源性下調circ-ZNF609可抑制肝細胞癌細胞的侵襲和遷移。生物信息學分析預測circ-ZNF609與miR-324-3p存在結合位點，RNA pull down實驗證實二者可靶向結合。進一步研究發現，肝細胞癌細胞中高表達的miR-324-3p可以抑制致癌因子RAP2C的表達，而circ-ZNF609過表達可部分逆轉這種抑制作用。綜上所述，肝細胞癌中circ-ZNF609通過與miR-324-3p靶向結合，導致miR-324-3p下游致癌靶基因RAP2C高水平表達從而發揮促癌作用。

2.3胃癌 LIU等[13]對40例胃癌手術切除的胃癌組織及癌旁正常組織樣本進行qRT-PCR定量檢測，發現胃癌組織中circ-ZNF609表達明顯高于癌旁正常組織，并且circ-ZNF609表達水平與胃癌分期及患者術后生存、淋巴結轉移情況密切相關。外源性沉默胃癌細胞中circ-ZNF609的表達后發現胃癌細胞的侵襲和遷移能力明顯下降；數據庫分析預測circ-ZNF609與miR-145-5p存在結合位點，雙熒光素酶分析檢測證實二者可直接結合。此外，該研究團隊指出，胃癌組織和細胞中miR-145-5p與circ-ZNF609的表達呈負相關；高表達的miR-145-5p通過直接靶向調控N-cadherin和E盒結合鋅指蛋白來抑制胃癌細胞的上皮間質轉化(EMT)。換言之，胃癌中高表達的circ-ZNF609通過miR-145-5p/CDH2/ZEB2軸促進胃癌細胞的EMT過程，進而增強胃癌細胞侵襲和遷移能力。

2.4結直腸癌 在結直腸癌中下調miR-150會增加神經膠質瘤關聯癌基因同源物1(Gli1)的表達，從而促進結直腸癌的發展[14-16]。WU等[17]研究發現，結直腸癌組織中circ-ZNF609和Gli1表達明顯高于癌旁正常組織；結直腸癌組織中miR-150呈低表達，且其表達水平與上述二者呈負相關。利用siRNA在結直腸癌細胞中外源性下調circ-ZNF609后，Gli1的mRNA和蛋白表達水平均下調，結直腸癌細胞的侵襲和遷移能力受到抑制。雙熒光素酶分析檢測聯合RNA pull down實驗證實circ-ZNF609和miR-150以及miR-150和Gli1存在靶向調控關系。上述實驗結果表明，過表達的circ-ZNF609在結直腸癌中作為miR-150競爭性內源RNA(ceRNA)，吸附miR-150，進而阻斷miR-150與下游靶基因結合，從而上調促癌因子Gli1的表達。

2.5腎癌 XIONG等[18]研究發現circ-ZNF609在腎癌組織中呈異常高表達，并且circ-ZNF609表達水平與腎癌腫瘤分期、組織學分級、血管侵犯、淋巴結轉移及遠處轉移密切相關。通過轉染siRNA外源性下調腎癌細胞內circ-ZNF609的表達后發現腎癌細胞的侵襲和遷移能力受到抑制。生物信息數據庫starBase提示circ-ZNF609與miR-138-5p存在結合位點，RNA免疫沉淀(RIP)結果證實circ-ZNF609能夠靶向吸附miR-138-5p進而下調其表達水平。進一步研究指出，過表達的miR-138-5p對下游靶基因FOXP4的抑制作用能夠被上調的circ-ZNF609逆轉。綜上所述，circ-ZNF609通過吸附miR-138-5p抑制miR-138-5p對下游靶基因FOXP4的負向調控，進而增強腎癌細胞侵襲和遷移能力。

2.6前列腺癌 前列腺癌是男性常見惡性腫瘤，放療和根治性手術是其重要臨床治療手段[19-20]。有報道顯示circRNA可以通過糖酵解途徑提高腫瘤抗輻射能力[21]。DU等[22]研究發現circ-ZNF609在前列腺癌細胞系中高表達，并且上調circ-ZNF609表達后前列腺癌細胞抗輻射能力明顯增強。進一步研究前列腺癌中circ-ZNF609的促癌機制，發現circ-ZNF609可以作為ceRNA直接靶向吸附miR-501-3p，上調前列腺癌細胞中己糖激酶2表達，進而通過糖酵解途徑增強前列腺癌細胞抗輻射能力。此外，JIN等[23]同樣發現circ-ZNF609在前列腺癌細胞系中高表達并且通過circ-ZNF609/miR-186-5p軸調控前列腺癌增殖等惡性生物學行為。

2.7鼻咽癌 ZHU等[24]研究發現circ-ZNF609在鼻咽癌組織和細胞中高表達，并且其表達水平與腫瘤遠處轉移、分期及患者預后顯著相關。生物信息學分析預測circ-ZNF609與miR-150-5p以及miR-150-5p與Sp1轉錄因子存在結合位點，RIP實驗進一步證實這一推測；qRT-PCR檢測發現miR-150-5p在鼻咽癌組織中表達明顯降低；Sp1作為miR-150-5p的靶基因，在鼻咽癌組織中高表達并且起促癌作用；利用siRNA沉默鼻咽癌細胞內circ-ZNF609表達后Sp1表達顯著下調，過表達circ-ZNF609對促癌因子Sp1表達的促進作用可被轉染miR-150-5p mimic部分逆轉。上述實驗結果提示，circ-ZNF609對鼻咽癌的調控作用通過miR-150-5p/Sp1軸實現。有研究表明鼻咽癌中miR-188可通過靶向調控多種細胞周期蛋白使細胞停留在G1和S期[25]；E74樣因子(ELF2)作為miR-188的靶基因，被證實在鼻咽癌組織和細胞中高表達，并且上調ELF2可促進鼻咽癌細胞的增殖和侵襲[26]。LI等[26]發現沉默circ-ZNF609能抑制腫瘤細胞增殖和侵襲，上調circ-ZNF609后miR-188表達明顯下降。進一步的促癌機制研究發現，高表達的circ-ZNF609借助ceRNA途徑阻止miR-188與靶基因ELF2 3' 端非編碼區的結合，從而上調促癌基因ELF2的表達。

2.8乳腺癌 WAND等[27]通過對143例乳腺癌組織樣本進行qRT-PCR檢測后發現，與正常組織相比，乳腺癌組織內circ-ZNF609表達明顯上調，并且circ-ZNF609異常表達水平與淋巴結轉移、TNM分期和患者生存率密切相關。外源性沉默circ-ZNF609后乳腺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力明顯下降；異體移植實驗結果顯示沉默circ-ZNF609可抑制小鼠體內乳腺癌生長速度；生物信息學分析預測及雙熒光素酶分析檢測顯示circ-ZNF609與miR-145-5p存在結合位點，p70S6K1是miR-145-5p下游靶基因；過表達的circ-ZNF609通過直接結合miR-145-5p進而上調下游促癌因子p70S6K1表達，從而促進乳腺癌發生和發展。

2.9橫紋肌肉瘤 circ-ZNF609是人類原代成肌細胞生長的關鍵調節劑。circ-ZNF609在2種主要的橫紋肌肉瘤亞型中高表達，即胚胎型和肺泡型。在胚胎型橫紋肌肉瘤衍生的細胞系中，沉默circ-ZNF609可誘導細胞停滯在G1和S期及下調p-Akt蛋白、pRb/Rb的表達水平。然而，相比于胚胎型橫紋肌肉瘤，circ-ZNF609在肺泡型橫紋肌肉瘤中未引起類似的細胞周期阻滯效應。由此可見，低表達的circ-ZNF609通過抵消p-Akt蛋白酶體依賴性降解而發揮細胞周期阻滯作用[28]，但更具體的上下游分子機制有待后續深入研究。

總之，circRNA因結構穩定和成環機制復雜，且具有多種生物學功能，成為近年研究熱點。circRNA在生物體內主要通過ceRNA機制與多種miRNA結合發揮各種調控作用。circ-ZNF609作為新發現的circRNA，能夠調控機體諸多病理生理過程，并且促進多種腫瘤惡性生物學行為。相信隨著研究的不斷深入，circ-ZNF609在腫瘤發生和發展中的作用機制會被更清晰地揭示，從而為腫瘤早期診斷和臨床治療提供新的思路及靶點。