miR-7977、NR4A1在狼瘡性腎炎腎組織中的表達及意義

張 丹，李國祝，王春蕾

系統性紅斑狼瘡為自身免疫性疾病，好發于生育期女性，常伴腎臟免疫復合物沉積[1]。腎小球系膜細胞在免疫調節中具有重要作用，受免疫復合物沉積的影響，可激活并釋放炎性因子，導致巨噬細胞、T淋巴細胞、樹突狀細胞浸潤，引起并放大炎癥反應，加重腎臟損傷[2]。狼瘡性腎炎(LN)作為系統性紅斑狼瘡最常見、最嚴重的并發癥，可進展為終末期腎臟病，及時、準確治療對患者預后具有重要意義[3]。microRNA(miRNA)是一種高度保守的內源性小RNA，可調控靶基因表達，參與細胞增殖、分化、凋亡等過程。近年有學者指出，miRNA在LN發病機制中占據重要地位[4]。核受體亞家族4A組成員1(NR4A1)是一種早期基因產物，廣泛參與生物的生長、代謝及炎癥調控。有研究發現，NR4A1可能參與LN的發生發展[5]。基于此，本研究選取126例系統性紅斑狼瘡為研究對象，評估患者腎組織miR-7977、NR4A1的表達水平及與LN病理分型的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月—2019年4月我院收治的126例系統性紅斑狼瘡為研究對象。根據腎穿刺活組織病理檢查結果將系統性紅斑狼瘡患者分為LN組與非LN組。根據國際腎臟病學會/腎臟病理學會工作組制定的病理分型標準[6]，評估LN患者的病理分型，分為輕微病變型LN(Ⅰ型)、系膜增生性LN(Ⅱ型)、局灶性LN(Ⅲ型)、彌漫性LN(Ⅳ型)、膜性LN(Ⅴ型)、硬化性LN(Ⅵ型)。

1.2納入與排除標準

1.2.1納入標準：符合美國風濕病學會制定的系統性紅斑狼瘡診斷標準[7]；均行經皮腎穿刺活組織病理檢查；患者及家屬均簽署知情同意書；經醫院醫學倫理委員會審批。

1.2.2排除標準：原發性腎臟病或其他繼發性腎臟病；近3個月行外科手術或有外傷史；合并內分泌系統或血液系統疾病；伴惡性腫瘤；合并腦血管意外或狼瘡性腦病；慢性傳染病或活動性感染性疾病；妊娠、哺乳或更年期婦女。

1.3方法

1.3.1miR-7977表達檢測：126例系統性紅斑狼瘡進行經皮腎穿刺活組織病理檢查，取腎組織冷凍研磨后，使用miRNA提取試劑盒(德國QIAGEN)提取總RNA，使用逆轉錄試劑盒(德國QIAGEN)將1 μg RNA逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR試劑盒(德國QIAGEN)，以U6作為內參，檢測miR-7977表達情況，按照2-ΔΔCt法計算相對表達量[8]。

1.3.2NR4A1表達檢測：取腎組織石蠟標本4 μm連續切片后脫蠟水化，經3%過氧化氫孵育、PBS沖洗、微波法抗原熱修復，然后滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育；分別滴加一抗工作液(上海瑞齊生物技術有限公司)4 ℃孵育過夜，復溫后PBS沖洗，滴加二抗工作液(羊抗兔，南京生興生物技術有限公司)，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗后滴加適量DAB；蘇木素復染5 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡檢。免疫組織化學評分方法：①根據視野內陽性細胞所占百分比計分，0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(25%～50%)、3分(50%～75%)、4分(≥75%)；②根據陽性細胞著色程度評分，0分(無色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)、3分(棕褐色)。每張切片隨機選取5個400倍視野，各視野上述2項評分相加，計算5個視野平均分，即為NR4A1表達評分。

1.4觀察指標 比較兩組腎組織miR-7977表達量及NR4A1表達評分差異，評估miR-7977表達量和NR4A1表達評分對LN的診斷價值，分析miR-7977表達量、NR4A1表達評分與LN患者病理分型的相關性。

2 結果

2.1基線資料比較 126例系統性紅斑狼瘡中，確診LN 58例(46.03%)，未發生LN 68例(53.97%)。兩組性別、年齡、病程、體質量指數(BMI)比較差異無統計學意義(P>0.05)。LN組腎小管萎縮、間質纖維化發生率均高于非LN組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 發生和未發生LN的系統性紅斑狼瘡兩組基線資料比較

2.2腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分比較 LN組腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分均高于非LN組，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 發生和未發生LN的系統性紅斑狼瘡兩組腎組織miR-7977、NR4A1表達水平比較

2.3腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分對LN的診斷價值分析 腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分對LN均有較高診斷價值(AUC分別為0.888、0.897)，最佳截斷值分別為0.34、3.50分。見表3、圖1。

表3 腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分診斷LN的ROC曲線分析

2.4不同病理分型LN患者腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分比較 58例LN中，病理分型為Ⅱ型7例(12.07%)，Ⅲ型11例(18.97%)，Ⅳ型25例(43.10%)，Ⅴ型15例(25.86%)。不同病理分型LN患者腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同病理分型LN患者腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分比較

2.5腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分與LN患者病理分型的相關性 腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分與LN患者病理分型無明顯相關性(r=0.127、0.131，P=0.275、0.263)。

3 討論

據文獻報道，LN的發生包括多個環節，如抗DNA抗體與免疫復合物誘導腎臟損傷、B淋巴細胞產生致病性自身抗體、輔助性T淋巴細胞參與激活B淋巴細胞、核小體增多或異常核小體出現等[9]。故體液免疫、細胞免疫、炎癥反應等多種病理過程均參與LN的發生發展。近年來，miRNA在腎臟疾病中的作用受到學術界廣泛關注，部分miRNA可介導細胞因子信號傳導抑制蛋白1的表達及促纖維化蛋白的生成，從而誘導LN發生[10-11]。目前miR-7977相關研究較少，但外國學者指出，miR-7977在LN中表達水平明顯升高，miR-7977可能參與LN發病機制[12]。NR4A1表達可被多種細胞因子調控，在機體生理、病理過程中發揮重要作用，現認為NR4A1可通過調控炎性細胞參與動脈粥樣硬化發病過程，且在腫瘤細胞增殖及凋亡中具有調控作用，NR4A1介導細胞凋亡也成為腫瘤治療的新靶點[13]。也有學者指出，NR4A1可通過介導PI3K/AKT信號通路，在腎臟疾病的發生發展中發揮作用[14]。因此，miR-7977及NR4A1可能與LN發病機制相關。本研究就腎組織miR-7977、NR4A1表達對LN的診斷價值及與病理分型的關系展開分析，為LN的臨床診療提供參考。

本研究結果顯示，LN組腎小管萎縮、間質纖維化發生率均高于非LN組。這也與LN患者彌漫性增生致腎小球壞死性病變及腎小管間質病變更為嚴重有關[15-16]。LN組腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分均高于非LN組，即LN患者腎組織miR-7977、NR4A1表達水平均升高。推測該結果由以下2種因素引起：①miR-7977可調節炎性介質釋放及淋巴細胞功能，腎組織miR-7977表達升高，使炎性介質釋放增多、免疫系統紊亂加劇，加速彌漫性增生性病變發生，引起LN[17]；②NR4A1可介導T淋巴細胞凋亡，并調控炎癥反應，腎組織NR4A1表達升高，也提示自身免疫性疾病及炎癥反應更嚴重，更易發生LN[18]。本研究也發現，腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分對LN均有較高診斷價值。提示miR-7977、NR4A1能夠用于LN的臨床診斷。腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分診斷LN的最佳截斷值分別為0.34、3.50分，可供臨床參考。

此外，LN病理分型中以Ⅳ型最嚴重，具有系膜細胞及內皮細胞彌漫性增生病變，常伴壞死性血管炎及血栓形成，嚴重影響患者腎功能[19]。本研究發現，Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型LN患者腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分略低于Ⅳ型患者，但組間比較差異無統計學意義。這也提示miR-7977及NR4A1可能在病變較輕的LN患者腎組織中表達水平低，但由于本研究樣本量有限，未得到顯著性結論。SAKAI等[20]提出，miRNA可通過多種途徑參與LN的病情進展，可作為LN治療的新靶點。然而本研究發現，LN患者腎組織miR-7977表達量、NR4A1表達評分與病理分型無明顯相關性，這也可能與本研究樣本量較少，結果存在偏倚有關。因此，腎組織miR-7977、NR4A1表達對評估LN病情進展有一定參考價值，但與病情進展的關系仍需后續研究證實。

綜上所述，LN患者腎組織miR-7977、NR4A1表達明顯升高，對LN診斷價值較高，或可作為LN診療的新靶點。