顱內動脈瘤患者手術前后血清miR-126、miR-125b表達變化及其臨床意義

鄢 偉，王靜靜，李曉東

顱內動脈瘤是引起蛛網膜下腔出血的重要原因，具有較高的致殘率和病死率[1-2]。因此，研究顱內動脈瘤的病理生理機制，對預防顱內動脈瘤具有重要意義。相關研究顯示，血管生成、細胞外基質合成及降解與顱內動脈瘤的發生密切相關[3]。而血管內皮生長因子(VEGF)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)是關鍵調節因子。microRNA(miRNA)是非編碼小分子RNA，可調控靶基因的表達[4]。miR-126基因位于9q34.3，可調節血管內皮細胞功能[5]。另外，血管平滑肌細胞異常可引起血管壁重塑，導致動脈瘤發生[6]。研究發現，miR-125b能調控血管平滑肌細胞表型轉化，與動脈瘤發生相關[7]。也有基礎研究發現，miR-126、miR-125b可通過調控VEGF及MMP-9參與疾病的發生[8]。但二者在顱內動脈瘤患者外周血中的表達及與臨床特征、預后、VEGF、MMP-9關系的報道較少，因此本研究對此進行分析，旨在為臨床治療提供參考，現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年8月—2020年8月于我院行手術治療的104例顱內動脈瘤的臨床資料，并設為觀察組，其中男60例，女44例；年齡35～80(42.16±5.77)歲。①納入標準：均符合顱內動脈瘤診斷標準[9]，并經腦血管造影確診；年齡30～80歲；既往無手術或藥物治療史，且顱內動脈瘤未破裂；臨床資料完整。②排除標準：合并嚴重器質性疾病者；合并惡性腫瘤者；有嚴重頭部外傷史；臨床資料不完整。對觀察組進行6個月的隨訪，根據不同預后分為生存組86例和死亡組18例。另選取同期進行體檢的健康者100例作為對照組，其中男62例，女38例；年齡35～75(41.98±5.70)歲。觀察組和對照組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準執行。

1.2方法

1.2.1治療方法：顱內動脈瘤患者均行顯微鏡外科手術治療，取平臥位，暴露穿刺部位，取單側翼點入路，顯微鏡下解剖外側裂池，導出腦脊液，顯露載瘤動脈，細心解剖瘤頸，采用動脈瘤夾夾閉動脈血管；可臨時阻斷處理載瘤動脈，0.9%氯化鈉注射液沖洗腦池，罌粟堿明膠海綿包裹載瘤動脈。手術完成后及時中和肝素，給予10 mg/100 ml尼莫地平注射液2～3 ml/h持續靜脈泵入24 h，連續用藥2周。同時采用我院自行設計的調查表收集患者一般資料。

1.2.2血清miR-126、miR-125b表達測定：觀察組入院后第1天和術后第7天采集晨起空腹靜脈血5 ml，對照組采集體檢日晨起空腹靜脈血5 ml，均以4000 r/min離心10 min，留取上清-80 ℃冰箱保存。取200 μl樣品，應用Trizol法提取血清中總RNA，用異丙醇沉淀總RNA后75%乙醇洗滌，8000 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥，50 μl的DEPC水溶解，NaroDrop檢測RNA溶液的濃度及純度，OD260/OD280為1.8～2.1。以總RNA為模板，逆轉錄合成cDNA，反應條件：37 ℃ 16 min，84 ℃ 6 s。qRT-PCR總反應體系20 μl，模板cDNA 1 μl，Taq聚合酶0.2 μl、正向及反向引物各1 μl、2×SYBRGreenmix 1 μl及20 mmol/L的dNTPs 1 μl，無RNA酶水14.8 μl。反應條件：96 ℃ 2 min，96 ℃ 15 s，62 ℃ 30 s，70 ℃ 10 s，共40個循環。miR-126引物正向：5'-ACACTCCAGCTGGGTCGTACCGTGAGTAAT-3'，反向：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCATTAT-3'；miR-125b引物正向：5'-GCCGTAAAGTGCTGACAGT-3'，反向：5'-GTGCAGGGTCCGAGGTAT-3'；內參基因U6引物正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：3'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5'。結果采用相對定量法表示，目的基因miR-126、miR-125b的表達分別采用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3血清MMP-9、VEGF水平測定：采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清MMP-9、VEGF水平，試劑盒由北京博爾邁生物技術有限公司提供，嚴格按照說明書進行操作。

1.3觀察指標 ①記錄觀察組手術前后及對照組血清miR-126、miR-125b表達及VEGF、MMP-9水平；②觀察術前血清miR-126、miR-125b表達與臨床特征的關系；③記錄生存組和死亡組術后血清miR-126、miR-125b表達水平；④分析術前血清miR-126、miR-125b與VEGF、MMP-9的相關性。

2 結果

2.1血清miR-126、miR-125b表達比較 觀察組術前和術后血清miR-126表達均高于對照組，miR-125b表達均低于對照組(P<0.05)；觀察組術后血清miR-126表達低于術前，miR-125b表達高于術前(P<0.05)。見表1。

表1 顱內動脈瘤患者和健康者兩組血清miR-126、miR-125b表達比較

2.2血清VEGF、MMP-9水平比較 觀察組術前和術后血清VEGF、MMP-9水平均高于對照組(P<0.05)；觀察組術后血清VEGF、MMP-9水平低于術前(P<0.05)。見表2。

表2 顱內動脈瘤患者和健康者兩組血清VEGF、MMP-9水平比較

2.3術前血清miR-126、miR-125b表達與顱內動脈瘤患者臨床特征關系 術前血清miR-126、miR-125b表達與年齡、性別、動脈瘤形態、動脈瘤位置無明顯關系(P>0.05)，而與動脈瘤數目、動脈瘤直徑有關(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 術前血清miR-126、miR-125b表達與顱內動脈瘤患者臨床特征關系

2.4不同預后顱內動脈瘤患者術后血清miR-126、miR-125b表達比較 生存組術后血清miR-126表達低于死亡組，miR-125b表達高于死亡組(P<0.01)。見表4。

表4 不同預后顱內動脈瘤患者術后血清miR-126、miR-125b表達比較

2.5術前血清miR-126、miR-125b表達與VEGF、MMP-9的相關性 顱內動脈瘤患者術前血清miR-126表達與VEGF、MMP-9呈正相關(r=0.381、0.369，P均<0.001)，miR-125b表達與VEGF、MMP-9呈負相關(r=-0.364、-0.405，P均<0.001)。見圖1。

3 討論

miRNA可調控人體的生長發育，且由于其表達穩定，已成為重要的生物學標志物[10]。研究發現，顱內動脈瘤患者存在異常miRNA表達譜，且生物學信息表明，miRNA可通過調節內皮細胞凋亡、平滑肌細胞增殖和遷移等方式參與顱內動脈瘤的發病機制[11]。miR-126可調控血管細胞黏附分子的表達，并影響血管內皮細胞增殖，參與血管生成和重塑[12]。本研究結果顯示，觀察組術前血清miR-126表達高于對照組，表明miR-126可能參與顱內動脈瘤發生發展，原因為顱內動脈瘤可促進血管生成，進而使miR-126高表達。miR-125是高度保守的miRNA家族，其異常表達與炎癥、免疫等密切相關[13]。研究表明，miR-125b在腹主動脈瘤中表達下調[14]。本研究結果顯示，觀察組術前血清miR-125b表達低于對照組，考慮與長鏈非編碼RNA對miR-125b的抑制作用有關。另外，觀察組術后血清miR-126表達低于術前，miR-125b表達高于術前，提示手術治療可改善患者血清miR-126、miR-125b表達。同時本研究顯示，觀察組血清miR-126、miR-125b表達與動脈瘤數目、動脈瘤直徑有關，其原因可能是顱內動脈瘤使miR-125b表達降低，導致MMP-9水平升高，MMP-9降低顱內動脈血管彈性，進而導致動脈瘤數目、直徑增大；miR-126可促進VEGF生成，從而降低動脈血管彈性，導致動脈瘤數目和直徑增大。本研究還發現，生存組術后血清miR-126表達低于死亡組，miR-125b表達高于死亡組，提示術后血清miR-126、miR-125b表達可為預后評估提供參考。

目前，有學者認為顱內動脈瘤是由動脈血管壁缺陷和顱內壓增高引起的[15]。GUO等[16]研究發現，VEGF、MMP-9參與顱內動脈瘤的發生。MMP-9高表達會加速細胞外基質降解，導致血管外膜纖維連接薄弱，加速動脈瘤形成。VEGF可促進MMP-9激活，并引起尿激酶型纖溶酶表達上調，進而發揮促細胞外基質降解作用[17-18]。本研究顯示，觀察組術前血清VEGF、MMP-9水平高于對照組，提示VEGF、MMP-9可能參與顱內動脈瘤發生；觀察組術后血清VEGF、MMP-9水平低于術前，提示手術可改善患者血清VEGF、MMP-9水平。另外，Spearman相關分析顯示，術前血清miR-126表達與VEGF、MMP-9呈正相關，miR-125b表達與VEGF、MMP-9呈負相關，提示血清miR-126表達升高和miR-125b表達降低均可升高VEGF、MMP-9。但本研究納入樣本量少且隨訪時間較短，可能影響結論，下一步將擴大樣本量并延長隨訪時間，以期更好地為臨床提供參考。

綜上所述，血清miR-126、miR-125b在顱內動脈瘤患者中存在異常表達，且與動脈瘤數目、直徑、預后及VEGF、MMP-9水平具有密切關聯。