miR-140-3p靶向凋亡基因BAX減輕白細胞介素-1β誘導的軟骨細胞損傷

王燚偉，田永利，馬廣恩，張永占

(秦皇島市第一醫院關節骨科，河北 秦皇島 066001)

骨關節炎是中老年人常見的慢性退行性關節病變，病因復雜且發病機制未完全闡明，至今仍缺乏特效的治療手段。關節軟骨細胞損傷在骨關節炎的發病中起重要作用，表現為軟骨細胞數量減少、細胞外基質合成及分解紊亂。近些年，微小RNA(microRNA，miR)在軟骨細胞損傷中的作用受到越來越多關注，不同的miRs可能通過調控細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激等環節在骨關節炎的發病過程中引起軟骨細胞損傷[1-3]。國內殷春明等[4]的一項臨床研究證實，骨關節炎患者關節液中miR-140-3p的表達水平呈降低趨勢，且關節病變越重miR-140-3p表達越低；Wang等[5]的研究在椎間盤退行性改變中證實miR-140-3p具有保護作用。基于此提出假設，骨關節炎發病過程中miR-140-3p起軟骨細胞保護作用，其表達降低會削弱保護作用并引起或加重軟骨細胞損傷。為了驗證這一假設，本研究以白細胞介素(interleukin，IL)-1β誘導軟骨細胞損傷模型為對象，通過細胞存活、細胞凋亡及相關基因表達的檢測分析了miR-140-3p的生物學作用及機制，旨在為闡明miR-140-3p在骨關節炎發病中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株 大鼠骨關節軟骨細胞株ATDC5(中科院上海細胞資源中心，中國)。

1.2 試劑 IL-1β(Sigma公司，美國)；miR-140-3p及陰性對照(NC)miR、陰性對照腺病毒(Ad-NC)及過表達Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associatal X protein，BAX)的腺病毒(Ad-BAX)(上海吉凱公司，中國)；miR提取、反轉錄及熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測試劑盒(北京天根生化公司，中國)；四唑化合物[3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，MTS]法細胞存活檢測試劑盒(Biovision公司，美國)；脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminal dexynucleotidyl transferase dutp nick end labeling，TUNEL)凋亡檢測試劑盒(上海翌圣生物公司，中國)；細胞裂解液(上海碧云天公司，中國)；BAX、裂解型Caspase-3(Cleaved caspase-3)(Abcam公司，美國)；雙熒光素酶報告基因及檢測系統(Promega公司，丹麥)。

1.3 儀器 細胞培養箱(Thermo公司，美國)；熒光定量PCR儀(Bio-rad公司)；顯微鏡(Nikon公司)；電泳系統及凝膠成像系統(Tanon公司)。

1.4 細胞培養及分組 ATDC5細胞在含有10%胎牛血清的培養基中進行貼壁培養，每2d更換1次培養基，待細胞融合達到80%時進行消化傳代。傳代的細胞接種在不同規格的培養板內并進行分組干預。細胞的分組干預共分入三部分，具體如下。第一部分：驗證IL-1β誘導ATDC5細胞損傷模型中miR-140、BAX表達的變化，細胞分為不同劑量IL-1β組，分別用含有0、1、5、10 ng/mL IL-1β的培養基處理。第二部分：驗證miR-140在IL-1β誘導ATDC5細胞損傷模型中的生物學作用，細胞分為miR-NC組、miR-NC+IL-1β組、miR-140+IL-1β組。miR-NC組轉染NC miR，miR-NC+IL-1β組轉染NC miR并加入IL-1β使其終濃度達到10 ng/mL，miR-140+IL-1β組轉染miR-140-3p并加入IL-1β使其終濃度達到10 ng/mL。第三部分：驗證BAX在miR-140減輕在IL-1β誘導ATDC5細胞損傷中的作用，細胞分為miR-NC+Ad-NC組、miR-NC+Ad-NC+IL-1β組、miR-140+Ad-NC+IL-1β組、miR-140+Ad-BAX+IL-1β組，在IL-1β處理、轉染NCmiR或miR-140-3p的基礎上感染NC腺病毒或BAX腺病毒。

1.5 miR-140-3p表達的檢測 ATDC5細胞分組干預24 h時采用試劑盒進行細胞中miR的提取，將miR反轉錄為對應的cDNA，使用miR-140-3p或U6的引物配置PCR反應體系，在PCR儀上進行熒光定量PCR反應，程序為95℃預變性3 min后95 ℃ 15 s、60 ℃ 34 s，并重復40個循環，得到PCR反應的循環曲線及循環閾值(Ct)，以U6為內參、按照公式2-ΔΔCt計算miR-140的表達水平。

1.6 BAX、Cleaved caspase-3表達的檢測 ATDC5細胞分組干預24 h時采用裂解液提取細胞蛋白，檢測蛋白濃度，將含有30 μg蛋白的樣本加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行western blot檢測，先進行電泳，而后電轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜，用5%脫脂牛奶在室溫封閉PVDF膜1 h，用1︰1 000稀釋的BAX、Cleaved caspase-3抗體或1︰5 000稀釋的β-actin抗體在4 ℃孵育PVDF膜過夜。第2天用1︰2 000稀釋的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)二抗在室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，根據條帶的灰度值、以β-actin為內參計算BAX、Cleaved caspase-3的表達水平。

1.7 細胞存活率的檢測 ATDC5細胞分組干預24 h時采用MTS法進行細胞存活率的檢測，按照試劑盒說明書進行操作并在酶標儀上檢測490 nm波長的吸光值，按照[(實驗孔吸光值-空白孔吸光值)/(對照孔吸光值-空白孔吸光值)×100%]計算細胞存活率。

1.8 細胞凋亡率的檢測 ATDC5細胞分組干預24 h時采用TUNEL法進行細胞凋亡率檢測，按照試劑盒說明書進行染色操作后在顯微鏡下隨機觀察3個高倍視野，對TUNEL陽性染色細胞、4，6-二氨基-2-苯基吲哚(4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI)陽性染色細胞進行計數，而后按照[(TUNEL陽性染色細胞/DAPI陽性染色細胞)×100%]計算細胞凋亡率。

1.9 生物信息學分析 在Targetscan數據庫(http：//www.targetscan.org)進行生物信息學分析，輸入miR-140-3p，分析BAX中與miR-140-3p互補配對的位點。

1.10 雙熒光素酶報告基因實驗 首先構建含有野生型BAX基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因，根據Targetscan網站中生物信息學預測的結果，將3’UTR中與miR-140-3p互補配對的堿基進行突變，得到突變型BAX雙熒光素酶報告基因。將野生型或突變型報告基因與miR-140-3p或NC miR共同轉染進入ATDC5細胞，48 h后采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測螢火蟲及海腎的熒光活力，計算螢火蟲與海腎熒光活力的比值作為雙熒光素酶報告基因的熒光活力。

2 結 果

2.1 IL-1β誘導ATDC5細胞損傷模型中miR-140-3p、BAX表達的變化 與0 ng/mL IL-1β組比較，1 ng/mL IL-1β、5 ng/mL IL-1β、10 ng/mL IL-1β組ATDC5細胞中miR-140-3p的表達水平均明顯降低，BAX的表達水平明顯增加，且隨著IL-1β濃度的增加ATDC5細胞中miR-140-3p的表達水平逐漸降低，BAX的表達水平增加(P<0.05，見圖1)。

a miR-140-3p表達比較 b BAX表達比較

2.2 miR-140-3p對IL-1β誘導ATDC5細胞損傷模型存活率及凋亡率的影響 采用熒光定量PCR檢測miR-140-3p的表達水平，結果見圖2a所示：與miR-NC組比較，miR-NC+IL-1β組ATDC5細胞中miR-140-3p的表達水平明顯降低(P<0.05)；與miR-NC+IL-1β組比較，miR-140+IL-1β組ATDC5細胞中miR-140-3p的表達水平明顯增加(P<0.05)。

采用MTS法檢測存活率、TUNEL法檢測凋亡率，結果見圖2b～d：與miR-NC組比較，miR-NC+IL-1β組ATDC5細胞的存活率明顯降低、凋亡率明顯增加(P<0.05)；與miR-NC+IL-1β組比較，miR-140+IL-1β組ATDC5細胞的存活率明顯增加、凋亡率明顯降低(P<0.05)。

a miR-140-3p表達水平比較

2.3 miR-140-3p對IL-1β誘導ATDC5細胞損傷模型中BAX、Cleaved caspase-3表達的影響 采用Western blot檢測BAX、Cleaved caspase-3的表達，結果見圖3所示：與miR-NC組比較，miR-NC+IL-1β組ATDC5細胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達水平明顯增加(P<0.05)；與miR-NC+IL-1β組比較，miR-140+IL-1β組ATDC5細胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達水平明顯降低(P<0.05)。

a BAX表達水平比較 b Cleaved caspase-3表達水平比較

2.4 miR-140-3p靶向調控ATDC5細胞中BAX的表達 在Targetscan網站進行生物信息學分析，結果見圖4a所示：BAX基因mRNA 3’UTR中含有miR-140-3p的結合位點；雙熒光素酶報告基因檢測結果見圖4b～c所示：與miR-NC組比較，miR-140-3p組ATDC5細胞中野生型BAX雙熒光素酶報告基因的熒光活力明顯降低(P<0.05)，突變型BAX雙熒光素酶報告基因的熒光活力無明顯變化(P>0.05)。

a miR-140-3p靶向調節BAX的生物信息學分析

2.5 過表達BAX對miR-140-3p減輕IL-1β誘導ATDC5細胞損傷的影響 采用Western blot檢測BAX、Cleaved caspase-3的表達，結果見圖5a～b所示：與miR-NC+Ad-NC組比較，miR-NC+Ad-NC+IL-1β組ATDC5細胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達水平明顯增加(P<0.05)；與miR-NC+Ad-NC+IL-1β組比較，miR-140+Ad-NC+IL-1β組ATDC5細胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達水平明顯降低(P<0.05)；與miR-140+Ad-NC+IL-1β組比較，miR-140+Ad-BAX+IL-1β組ATDC5細胞中BAX、Cleaved caspase-3的表達水平明顯增加(P<0.05)。

a 細胞BAX表達水平比較 b 細胞Cleaved caspase-3表達水平比較

采用MTS法檢測存活率、TUNEL法檢測凋亡率，結果如圖2c～e所示：與miR-NC+Ad-NC組比較，miR-NC+Ad-NC+IL-1β組ATDC5細胞的存活率明顯降低、凋亡率明顯增加(P<0.05)；與miR-NC+Ad-NC+IL-1β組比較，miR-140+Ad-NC+IL-1β組ATDC5細胞的存活率明顯增加、凋亡率明顯降低(P<0.05)；與miR-140+Ad-NC+IL-1β組比較，miR-140+Ad-BAX+IL-1β組ATDC5細胞的存活率明顯降低、凋亡率明顯增加(P<0.05)。

3 討 論

軟骨細胞損傷在骨關節炎發病中的作用受到越來越多的關注，在軟骨細胞發生損傷的過程中，細胞數量不斷減少、細胞外基質持續水解，最終導致軟骨彈性下降及骨贅形成[6-8]。目前，骨關節炎發病過程中軟骨細胞損傷的發生機制尚不完全明確，國內外兩項臨床研究均證實骨關節炎患者關節液中miR-140-3p表達降低與病情加重有關[4，9]，另有miR-140-3p相關的基礎研究證實該miR對椎間盤的退行性改變具有保護作用[5]。以上國內外的研究結果提示具有保護作用的miR-140-3p表達降低與骨關節炎的發病有關，本文將以miR-140-3p為切入點研究骨關節炎的發病機制。

IL-1β誘導軟骨細胞損傷模型是目前研究骨關節炎發病機制常用的細胞模型，軟骨細胞在IL-1β的刺激下會出現存活率降低、凋亡率增加的損傷表現[9-10]。本研究在細胞模型中檢測到miR-140-3p的表達水平明顯降低，與相關臨床研究中miR-140-3p表達降低的結果一致。在IL-1β誘導軟骨細胞損傷模型中，本研究也檢測到細胞存活率降低、凋亡率增加，與既往骨關節炎細胞模型相關的研究結果[10-11]一致。為了探究miR-140-3p在IL-1β誘導軟骨細胞損傷中的作用，本研究在IL-1β誘導軟骨細胞損傷的過程中轉染miR-140-3p使其表達增加，分析結果顯示過表達miR-140-3p使細胞的存活率增加、凋亡率降低，表明miR-140-3p對IL-1β誘導軟骨細胞損傷具有保護作用。

BAX是體內重要的凋亡基因，骨關節炎發病過程中軟骨細胞凋亡與BAX的高表達有關。多項臨床和基礎研究均證實，骨關節炎患者及動物的關節軟骨中BAX的表達明顯增加[12-14]。本研究在IL-1β誘導軟骨細胞損傷模型中BAX的表達水平增加，與既往臨床和基礎研究的結果吻合。BAX參與線粒體途徑凋亡的調控，通過增加線粒體內細胞色素C釋放啟動級聯反應，增加Cleaved caspase-3的表達并引起細胞凋亡[15-16]。過表達miR-140-3p后，IL-1β誘導軟骨細胞損傷模型中BAX、Cleaved caspase-3的表達降低，與miR-140-3p抑制IL-1β誘導軟骨細胞凋亡的作用吻合，也提示miR-140-3p抑制凋亡的作用可能與抑制BAX所介導的線粒體途徑凋亡有關。

miRs對靶基因表達的調控作用通過識別并結合3’UTR、促進mRNA降解或阻礙mRNA的翻譯來實現。本研究在Targetscan數據庫進行了在線生物信息學分析，BAX基因3’UTR中含有miR-140-3p互補配對的堿基；利用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證，miR-140-3p使BAX野生型報告基因的熒光活力降低，將報告基因中miR-140-3p互補配對的堿基突變后，miR-140-3p不再影響報告基因的熒光活力，由此證實miR-140-3p靶向BAX基因的3’UTR。在此基礎上本研究還通過感染腺病毒、過表達BAX的方式驗證了BAX在miR-140-3p減輕IL-1β誘導軟骨細胞損傷中的作用，結果顯示：過表達BAX后miR-140-3p使IL-1β誘導軟骨細胞損傷模型存活率增加及凋亡率、Cleaved caspase-3表達降低的作用明顯減弱，表明miR-140-3p的保護作用與靶向抑制BAX有關。

綜上所述，miR-140-3p對IL-1β誘導軟骨細胞損傷模型具有保護作用，能夠增強細胞活力、抑制細胞凋亡并靶向抑制凋亡基因BAX的表達，抑制BAX介導的細胞凋亡是miR-140-3p發揮上述保護作用的相關分子機制。這為今后研究骨關節炎的發病機制、骨關節炎發病過程中軟骨細胞損傷的分子機制提供了新思路和新靶點。