荔枝蜂蜜醋發(fā)酵工藝優(yōu)化與揮發(fā)性成分分析

潘偉杰，林捷*，鄭華，陳少華，江俊梅，付章平

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院（廣州 510642）；2. 惠州富潤康食品有限公司（惠州 516800）

蜂蜜是蜜蜂從開花植物的花蜜中收集起來，在蜂巢中經(jīng)過轉(zhuǎn)化、沉積、脫水等過程形成的天然甜味劑[1]。蜂蜜的營養(yǎng)成分豐富，含有單糖、蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、礦物質(zhì)、微量元素、維生素、芳香化合物等多種有益的成分，對人體的健康有許多積極的影響[2]。研究表明蜂蜜有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等作用[3]。目前，蜂蜜的深加工產(chǎn)品有蜜飲料[4]、蜂蜜酒[5]、蜂蜜酸奶[6]等。

荔枝蜜是華南地區(qū)特色的蜂蜜，其香氣宜人，揮發(fā)性成分種類主要包括芳香類、醇類、酮類、酯類、醛類等，有著特殊的鮮荔枝清香味[7]。蜂蜜醋是以蜂蜜為原料，經(jīng)過微生物發(fā)酵而形成，產(chǎn)生豐富的代謝物，增加有機酸、氨基酸等營養(yǎng)成分，口感柔和，香氣馥郁。蜂蜜醋研究大多數(shù)以總酸為指標優(yōu)化工藝，未結(jié)合產(chǎn)品風(fēng)味進行感官評價。食品的感官評定是在理化分析的基礎(chǔ)上，通過視覺、嗅覺、味覺等感知到的食品的特征性質(zhì)進行反應(yīng)、測量、分析和解釋的一門科學(xué)[8]。模糊數(shù)學(xué)感官評價是基于模糊數(shù)學(xué)的函數(shù)理論對影響食品感官風(fēng)味評價的各因素關(guān)系進行數(shù)學(xué)運算，并建立反映其本質(zhì)屬性的數(shù)學(xué)評價體系的方法，結(jié)果科學(xué)客觀[9]。試驗以荔枝蜜為原料發(fā)酵蜂蜜醋，通過單因素試驗及正交試驗優(yōu)化蜂蜜醋發(fā)酵工藝，并且利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HS-SPME-GC-MS）測定蜂蜜醋的揮發(fā)性成分。該試驗為開發(fā)酸味豐富、香氣濃郁的蜂蜜醋產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

荔枝蜜（70 Brix）、蜂蜜醋發(fā)酵菌（4 ℃保藏于無菌容器），惠州富潤康食品有限公司提供。亞甲藍、亞鐵氰化鉀、冰乙酸、硫酸、酒石酸鉀鈉、鹽酸、乙醇、硫酸銅、酚酞、乙酸鋅、氫氧化鈉、無水葡萄糖等均分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DGL-35B滅菌鍋（浙江力辰儀器科技有限公司）；UV1240分光光度計（日本島津儀器有限公司）；HG303-3生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；TDL-5C離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TSQ 8000 Evo三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

荔枝蜂蜜→純水稀釋→巴氏滅菌→接入發(fā)酵菌種→恒溫發(fā)酵→過濾→殺菌→灌裝

1.3.2 試驗設(shè)計

1.3.2.1 單因素試驗

分別設(shè)置：菌種接種量2%，4%，6%，8%和10%；初始糖度7，9，11，13和15 Brix；發(fā)酵溫度25，30，35和40 ℃。培養(yǎng)25 d，測定各指標，考察各因素對蜂蜜醋的影響。

1.3.2.2 正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，按照表1進行正交試驗。

1.4 模糊數(shù)學(xué)感官評價法[10-11]

1.4.1 建立模糊數(shù)學(xué)模型

建立因素集：設(shè)定k1=滋味，k2=氣味，k3=外觀，得到蜂蜜醋模糊感官分析的因素集K={k1，k2，k3}。

建立評語集：經(jīng)感官評定小組討論確定成品蜂蜜醋評價等級：好（90）、較好（70）、差（50）；設(shè)定X1=好，X2=較好，X3=差，得到蜂蜜醋模糊感官分析的評語集X={X1，X2，X3}。

建立權(quán)重集：結(jié)合產(chǎn)品風(fēng)味特點，將蜂蜜醋中滋味、氣味、外觀的權(quán)重分數(shù)分別設(shè)定為0.6，0.3和0.1；設(shè)定R1=滋味，R2=氣味，R3=外觀，蜂蜜醋感官分析的權(quán)重集R={R1，R2，R3}。

模糊綜合評判集：模糊數(shù)學(xué)綜合評定為Y=R×U，其中R為權(quán)重集，U為模糊數(shù)學(xué)矩陣，U是由每個感官因素中每一種評語的人員數(shù)除以總的評定人員得到的。

1.4.2 感官評價方法

所有蜂蜜醋樣品均采用統(tǒng)一的容器盛裝并采用3位數(shù)字隨機編號，由感官鑒賞小組進行感官評價。感官鑒賞小組由10名食品專業(yè)研究生及老師組成，模糊感官評價表如表2所示。

表2 荔枝蜂蜜醋感官評價標準

1.5 測定方法

1.5.1 總酸的測定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。

1.5.2 總酯的測定

參照GB/T 10345—2007中的總酯的測定方法，測定蜂蜜醋的總酯含量。

1.5.3 HS-SPME-GC-MS檢測方法

參照文獻[12]的方法。取8 mL蜂蜜醋飲料于SPME樣品瓶中，設(shè)置孵化爐溫度50 ℃，將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入樣品瓶中，吸附30 min后在進樣口中解析5 min。色譜柱為TG-5MS（60 m×0.25 mm×0.50 μm）。升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升溫至160 ℃，保持2 min，再以4 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。質(zhì)譜電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z35～500。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0、Origin、Microsoft Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析與作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 菌種接種量對蜂蜜醋品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著接種量的增加，荔枝蜂蜜醋中總酯含量逐漸增加，總酸及感官評分呈先增加后減少的趨勢，總酸最高達11.73 g/L，與劉功良等[13]研究的菌種接種量對荔枝蜜醋發(fā)酵的影響結(jié)論一致，接種量過大不利于總酸的積累。當接種量為6%時，感官評價最優(yōu)，整體風(fēng)味呈現(xiàn)出酸感柔和，香味宜人。

圖1 接種量對荔枝蜂蜜醋品質(zhì)的影響

2.1.2 初始蜂蜜糖度對蜂蜜醋品質(zhì)的影響

菌種的發(fā)酵過程，除了產(chǎn)生多種有機酸，還有一些副產(chǎn)物如高級脂肪酸、琥珀酸等，這些物質(zhì)能與乙醇作用產(chǎn)生酯類，賦予芳香[14]。由圖2可知，隨著發(fā)酵液初始糖度增加，荔枝蜂蜜醋總酯含量和感官評分持續(xù)上升，總酸含量先增加后減少，當初始糖度為13 Brix時，總酸含量達最大值。初始糖度較低時，總酸積累量較低，風(fēng)味物質(zhì)不夠豐滿；糖度過高時，菌種生長旺盛，產(chǎn)生大量的ATP抑制EMP途徑關(guān)鍵酶磷酸果糖激酶的活性，且丙酮酸激酶的活性也受到抑制，導(dǎo)致糖酵解途徑受到抑制，總酸積累量降低[15]。

圖2 初始糖度對荔枝蜂蜜醋品質(zhì)的影響

2.1.3 發(fā)酵溫度對蜂蜜醋品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，荔枝蜂蜜醋的總酸含量和感官評分呈先增加再減少的趨勢，與周文俊[16]研究溫度對醋酸菌產(chǎn)酸產(chǎn)酯的影響一致，高溫抑制乙醇氧化酶的活性，加速風(fēng)味物質(zhì)的揮發(fā)，總酸、總酯含量較低，影響產(chǎn)品的感官風(fēng)味。在35 ℃時，總酸含量和感官評分達最大值，此時蜂蜜醋香氣濃郁，口感清爽。

圖3 發(fā)酵溫度對荔枝蜂蜜醋品質(zhì)的影響

2.2 模糊感官數(shù)學(xué)評價法優(yōu)化正交試驗結(jié)果

2.2.1 模糊感官數(shù)學(xué)評價

由10名感官評價成員對正交試驗9組的蜂蜜醋進行感官評價，評定結(jié)果見表3，表中數(shù)字表示各等級評價的人數(shù)。以樣品385為例，滋味評分在40～60分有3人，19～39分有5人，1～18分有2人。

表3 蜂蜜醋感官評價結(jié)果 單位：人

2.2.2 建立模糊評價矩陣

參考張佳匯等[10]的方法。以編號136的樣品為例。將蜂蜜醋感官評價結(jié)果各等級評價人數(shù)分別除以總感官評價人數(shù)，建立滋味、氣味、外觀的模糊評價矩陣，分別為：u1=[0.8 0.2 0]，u2=[0.7 0.3 0]，u3=[0.9 0.1 0]。則樣品136的模糊感官評價矩陣U1可以表示為：

2.2.3 模糊數(shù)學(xué)感官評價綜合分析

模糊數(shù)學(xué)綜合評定為Y=R×U，以編號136的樣品為例，其模糊數(shù)學(xué)綜合評價為：

同理，得到各組蜂蜜醋的模糊數(shù)學(xué)感官評價結(jié)果，然后分別乘以評語集X={X1，X2，X3}={好，較好，差}={90，70，50}。求和得到各組的模糊數(shù)學(xué)感官評價結(jié)果，如表4所示。根據(jù)模糊數(shù)學(xué)感官評價分析，樣品136的綜合評分最高，達到85.6分，說明其感官風(fēng)味最佳，受到感官評價人員的喜愛。結(jié)合表5可知，樣品136酸度較高，酸感柔和，蜜香濃郁。

表4 正交組蜂蜜醋感官評價結(jié)果

2.2.4 正交試驗結(jié)果分析

由表5可知，影響模糊感官評分的主次因素排序為初始糖度＞溫度＞接種量。正交試驗分析以模糊感官評分為主要指標，化學(xué)指標作為參考。樣品136模糊感官評分最高，綜合其滋味、氣味和外觀，受到感官評定人員的認可。依據(jù)K值分析可知，蜂蜜醋發(fā)酵工藝優(yōu)化最佳試驗方案為A1B2C3。以最佳試驗方案進行驗證試驗，測得蜂蜜醋總酸13.68 g/L、總酯86.73 mg/L。通過模糊感官評價分析，感官評分為86.8分。

表5 蜂蜜醋發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析

2.3 HS-SPME-GC-MS結(jié)果

用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HSSPME-GC-MS）法測定蜂蜜醋發(fā)酵的揮發(fā)性物質(zhì)，結(jié)果見表6。共測得56種揮發(fā)性成分。其中酸類物質(zhì)有5種，醇類物質(zhì)有6種，酯類物質(zhì)有14種，酮類物質(zhì)有10種，醛類物質(zhì)有8種，呋喃類物質(zhì)7種。所有揮發(fā)性成分中酸類物質(zhì)含量為67.21%，占比例最多。其次是醇類物質(zhì)14.83%，酮類物質(zhì)10.19%，酯類物質(zhì)2.82%，呋喃類物質(zhì)1.57%，醛類物質(zhì)1.71%。可見，酸類、醇類、酮類、酯類物質(zhì)是荔枝蜂蜜醋揮發(fā)性香味物質(zhì)的主要化合物。與馬磊[17]研究的荔枝蜜醋進行比較，可以發(fā)現(xiàn)共同的化合物有苯乙醇、苯乙酸乙酯、異丁酸、壬醛、辛醛等。

表6 蜂蜜醋揮發(fā)性化合物HS-SPME-GC-MS結(jié)果

乙酸占總揮發(fā)性物質(zhì)的55.85%，是醋的主要揮發(fā)性風(fēng)味成分，主要提供醋酸味、醋香味。異戊酸和異丁酸含量較高，異戊酸主要貢獻酸味，異丁酸帶有酸味和奶酪香氣，和黃丹等[18]研究一致，酯類化合物是食醋中種類最多的一種化合物。酯類物質(zhì)大多具有水果香，乙酸乙酯具有蘋果、香蕉的香氣，乙酸異戊酯具有梨的甜香味，是蜂蜜醋重要的呈香物質(zhì)。酮類物質(zhì)中乙偶姻、3-乙酰基-2-丁酮和2, 3-丁二酮含量較高。其中乙偶姻為8.39%，具有奶油香和甜香，是蜂蜜醋重要的香氣成分。醇類物質(zhì)中氧化芳樟醇含量為14.36%，具有玫瑰花香、樟腦木香、甜味。醛類物質(zhì)中壬醛具有甜橙味、玫瑰花香，糠醛具有焦糖味，苯甲醛有果香、杏仁味，辛醛具有橘子水果味[19-20]。這些物質(zhì)共同構(gòu)成蜂蜜醋獨特的風(fēng)味。

接表6

3 結(jié)論

模糊數(shù)學(xué)法可以更加客觀地對產(chǎn)品進行感官評價，彌補僅靠理化指標優(yōu)化工藝參數(shù)的缺陷。結(jié)合總酯、總酸等指標，優(yōu)化蜂蜜醋發(fā)酵工藝，確定菌種接種量4%、發(fā)酵溫度25 ℃、蜂蜜發(fā)酵液糖度15 Brix。該條件下發(fā)酵形成的蜂蜜醋口感豐富、酸味柔和、香味濃郁，有明顯光澤，模糊數(shù)學(xué)感官評分為86.8分。通過HS-SPME-GC-MS法測定蜂蜜醋揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，測得56種揮發(fā)性化合物，其中酸類物質(zhì)有5種（67.21%），醇類物質(zhì)有6種（14.83%），酯類物質(zhì)有14種（2.82%），酮類物質(zhì)有10種（10.19%），醛類物質(zhì)有8種（1.71%），呋喃類物質(zhì)7種（1.57%），這些化合物共同構(gòu)成蜂蜜醋獨特的醋香風(fēng)味。