響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹白藜蘆醇的提取工藝及動(dòng)力學(xué)研究

文海朝，李學(xué)靜，王汗鑫，王云鶴，趙敏琦，李紅姣*

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（保定 071000）

白藜蘆醇是植物次生代謝產(chǎn)生的一種多酚類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抗氧化[1]、抗癌[2]、保護(hù)神經(jīng)[3]等多種藥用保健功效。提取白藜蘆醇物質(zhì)的主要天然材料有虎杖[4]、爬山虎根皮[5]、轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻[6]、花生根[7]、桑椹[8-10]等，但這些天然資源受地域、季節(jié)等自然條件的限制，其開發(fā)利用程度有限，不能完全滿足市場(chǎng)需求[11]。

桑椹是桑樹（Morus albaL.）的成熟果穗，具有抗氧化、保肝、消炎、降血糖[12]、增強(qiáng)免疫力等功能。有研究表明，桑椹中白藜蘆醇含量不低于甚至高于葡萄、花生、藍(lán)莓等植物[13]。葛亮等[9]研究?jī)?yōu)化了利用超聲波提取桑椹中白藜蘆醇的提取應(yīng)用工藝；陳瓊玲等[10]利用響應(yīng)面法優(yōu)化桑椹中白藜蘆醇的提取工藝；曹喜濤等[8]采用響應(yīng)面法優(yōu)化白藜蘆醇的提取工藝條件。上述研究通過(guò)不同提取方法，確定白藜蘆醇提取工藝的參數(shù)，但并未涉及提取過(guò)程中的動(dòng)力學(xué)研究，無(wú)法得出白藜蘆醇提取過(guò)程中的關(guān)鍵控制步驟。

試驗(yàn)以桑椹凍干粉為材料，基于單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，分析影響MR提取得率的因素，并優(yōu)化MR的提取工藝；深入分析MR提取過(guò)程中的各種影響因素及提取動(dòng)力學(xué)，得出MR提取過(guò)程中的關(guān)鍵控制步驟，為開展白藜蘆醇的規(guī)模化提取及拓寬白藜蘆醇植物資源的利用提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮成熟的桑椹品種“孟簡(jiǎn)”，采自河北省定州市，采摘時(shí)桑椹成熟度一致，大小均勻，無(wú)腐敗變質(zhì)，采后冷凍干燥后粉碎過(guò)篩（50目，孔徑0.297 mm），在-80 ℃條件下儲(chǔ)藏備用。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

精確稱取適量白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，用60%乙醇水溶液溶解并調(diào)整至最終質(zhì)量濃度分別為0.005，0.010，0.015，0.020和0.025 mg/mL，以60%乙醇水溶液為空白對(duì)照，分別測(cè)定A305nm。以白藜蘆醇質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以A305nm為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析。

1.3 MR提取工藝優(yōu)化

1.3.1 MR提取的單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.2 g桑椹凍干粉于10 mL離心管中，按表1進(jìn)行水浴加熱，水浴結(jié)束后過(guò)濾，7 000 r/min下離心10 min，取0.5 mL上清液，測(cè)定A305nm。以MR的提取得率作為響應(yīng)值，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取溫度等因素對(duì)MR提取得率的影響。

表1 MR提取單因素試驗(yàn)的因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法，設(shè)計(jì)四因素三水平的試驗(yàn)方案，優(yōu)化MR提取工藝。

1.4 提取動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取0.2 g（精確至±0.001 g）桑椹凍干粉置于離心管中，加入4 mL的60%乙醇溶液混合作提取液，液料比20∶1 g/mL，均勻混合后放置于恒溫水浴鍋內(nèi)，提取溫度分別設(shè)置為40，45，50，55 和60℃，于提取0.5，1.0，1.5，2.0、2.5，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0 h時(shí)分別取樣，離心后取上清液在305 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MR提取得率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法和分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單因素對(duì)MR提取得率的影響

2.1.1 溫度對(duì)MR提取得率的影響

由圖1可看出：隨著提取溫度升高，MR提取得率隨之增大，溫度50 ℃時(shí)，MR提取得率達(dá)到最大；繼續(xù)升高溫度，MR提取得率減小。由此可知，溫度達(dá)到50 ℃時(shí)MR提取效果最好。

圖1 提取溫度對(duì)MR提取得率的影響

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)MR提取得率的影響

如圖2所示：隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，MR提取得率會(huì)隨之增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)，MR提取得率最大；乙醇體積分?jǐn)?shù)大于50%并繼續(xù)增大時(shí)，MR提取得率會(huì)隨之減小。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%時(shí)MR提取效果最好。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)MR提取得率的影響

2.1.3 液料比對(duì)MR提取得率的影響

由圖3可以看出：隨著液料比增加，MR提取得率呈逐步增大趨勢(shì)，液料比20∶1 mL/g時(shí)，MR提取得率達(dá)到最大；液料比大于20∶1 mL/g時(shí)，MR提取得率會(huì)隨之減小。由此可知，液料比20∶1 mL/g時(shí)提取效果可達(dá)到最好。

圖3 液料比對(duì)MR提取得率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)MR提取得率的影響

由圖4可知：隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，MR提取得率呈略微增大趨勢(shì)，提取1.5 h時(shí)，MR提取得率可達(dá)最大；提取時(shí)間繼續(xù)后移，MR提取得率會(huì)逐漸減小。在1.0和1.5 h條件下，提取MR得率變化不顯著，選擇提取時(shí)間1.0 h為后續(xù)試驗(yàn)條件。

圖4 提取時(shí)間對(duì)MR提取得率的影響

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

以中心組合設(shè)計(jì)原理為理論依據(jù)，以MR提取得率（mg/g）為響應(yīng)值，用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)因素及水平編碼表見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)次數(shù)共計(jì)29次，通過(guò)響應(yīng)面回歸分析，試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。由表4可知，建立的回歸模型p＜0.01，表現(xiàn)為極顯著，而模型失擬項(xiàng)p=0.097＞0.05，表現(xiàn)為不顯著，綜合回歸模型和失擬項(xiàng)顯著性結(jié)果可知回歸模型擬合較好，此模型可用于預(yù)測(cè)各項(xiàng)因素對(duì)MR提取得率的影響。運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和擬合后，得出以下函數(shù)，可以表示各因素對(duì)MR提取得率的影響：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

表4 回歸方程方差分析表

Y=0.69-0.018A+0.025B+0.069C-7.156E-003D-0.020AB+0.012AC+3.320E-003AD+0.014BC-7.846E-004BD+0.021CD+7.431E-003A2+0.027B2-7.638E-003C2+0.021D2

根據(jù)模型進(jìn)行分析并回歸后，得出MR最優(yōu)提取工條件：提取溫度41.44 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)59.99%，液料比25.00∶1 mL/g，提取時(shí)間1.5 h。MR提取得率預(yù)測(cè)值最高可以達(dá)到0.877 mg/g。經(jīng)驗(yàn)證，在此試驗(yàn)條件下，MR提取得率為0.841 mg/g，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異。

2.3 提取動(dòng)力學(xué)

2.3.1 動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)1.4的方法分別在不同溫度條件下考察MR隨時(shí)間變化的提取情況，結(jié)果如圖5所示。隨著溫度升高，MR提取得率增大，提取達(dá)到平衡的持續(xù)時(shí)間縮短。提取的初始階段，隨著溫度不斷升高和時(shí)間延長(zhǎng)，MR提取得率會(huì)迅速增大，隨后，提取得率增加逐漸緩慢，直至達(dá)到平衡穩(wěn)定狀態(tài)。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是提取過(guò)程的初始階段，乙醇溶液逐漸深入到桑椹凍干粉顆粒內(nèi)部，MR被快速溶解，桑椹凍干粉顆粒內(nèi)外溶液產(chǎn)生高濃度差，促使MR快速浸出，提取得率較高，隨著提取時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，MR浸出量逐漸增加，溶液中MR含量逐漸增大，溶液濃度差逐漸減小，提取速率逐漸減小，直至趨于平衡。總體上看，MR提取過(guò)程在0～2 h內(nèi)變化較快，該階段為提取動(dòng)力學(xué)區(qū)域。

圖5 不同溫度下MR提取得率與時(shí)間的關(guān)系

2.3.2 桑椹中白藜蘆醇液固相浸提的動(dòng)力學(xué)模型擬合

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，0～2 h為白藜蘆醇的提取動(dòng)力學(xué)階段，將該階段試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別代入固-液相浸提的不同的動(dòng)力學(xué)方程中，結(jié)果如表5所示。

表5 固液相浸提的動(dòng)力學(xué)模型擬合試驗(yàn)數(shù)據(jù)所得參數(shù)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)與內(nèi)擴(kuò)散模型的動(dòng)力學(xué)方程擬合效果最佳，表明MR的提取過(guò)程為內(nèi)擴(kuò)散控制的動(dòng)力學(xué)模型，提取速度決定于內(nèi)擴(kuò)散的速度，因此減小桑椹凍干粉顆粒的直徑或升高溫度，有助于提高桑椹凍干粉中MR提取速率。

2.3.3 MR提取的表觀活化能

MR提取過(guò)程中的速率常數(shù)與提取溫度的關(guān)系一般遵循Arrhenius公式[14]，兩邊同時(shí)取自然對(duì)數(shù)得式（1）。

lnk=lnA-Ea/RT（1）式中：Ea為表觀活化能，kJ/mol；A為指前因子或頻率因子；k為速率常數(shù)；R為氣體常數(shù)，8.314 J/mol·K；T為溫度，K。據(jù)此求得表觀活化能Ea=22.125 kJ/mol。一般內(nèi)擴(kuò)散控制的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)前后顆粒直徑不變，且表觀活化能在8～30 kJ/mol的范圍內(nèi)。試驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[10, 15-16]的植物有效成分提取的表觀活化能相吻合，符合內(nèi)擴(kuò)散的活化能范圍。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)MR的提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，得出最優(yōu)提取條件：提取溫度41.44℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)59.99%，液料比25.00∶1 mL/g，提取時(shí)間1.5 h，MR提取得率預(yù)測(cè)值最高可達(dá)0.877 mg/g。MR提取過(guò)程與固液相提動(dòng)力學(xué)模型中內(nèi)擴(kuò)散模型擬合效果最佳，因此MR的提取過(guò)程為內(nèi)擴(kuò)散控制的動(dòng)力學(xué)模型。