發芽法富集蒜米γ-氨基丁酸的關鍵技術

高紅俠，白青云*，趙立，盧河東，王雨

淮陰工學院生命科學與食品工程學院（淮安 223003）

大蒜（Allium sativumL）又名胡蒜，屬百合科蔥屬植物。大蒜鱗莖除含有碳水化合物、蛋白質等基本營養素外，還富含維生素、含硫化合物，以及鍺和硒等多種微量元素[1]。藥理學研究表明，大蒜提取物具有廣譜抗菌作用，能阻斷人體內亞硝胺合成等作用，對直腸癌、食道癌等有預防作用，同時還能提高免疫力、抗血栓、保護肝臟等功能[2]。

大蒜食用時存在去皮困難、費時等問題，因此大蒜去皮后的蒜米受到消費者青睞。蒜米是具有新陳代謝能力的活體，對蒜米進行發芽處理能富集γ-氨基丁酸（GABA）。GABA是生物體內廣泛存在的一種非蛋白質氨基酸，由谷氨酸經谷氨酸脫羧酶（GAD）轉化而來[3]。GABA是哺乳動物腦和脊髓中的抑制性神經遞質，具有降血壓、抗癌、抗腫瘤、改善腦功能等功效[4]。最新研究表明，體內GABA水平與帕金森患者的記憶力呈正相關[5]。我國已批準GABA為新食品原料[6]，動植物性食物原料中GABA質量分數很低，很難從天然食物中大量攝取。因此，食物中富集GABA成為功能食品研究熱點之一。

試驗選用種植面積廣、功能豐富的蒜米作為原料，采用發芽法，研究蒜米富集GABA的關鍵技術，為開發功能性大蒜產品提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜，市售；GABA標準品，購自美國Sigma化學品公司；谷氨酸鈉（MSG）、維生素B6（VB6）、氯化鈣（CaCl2）、乙醇、乙酸、四硼酸鈉、苯酚、次氯酸鈉等，均購于國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

722N可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；TDL-40B型離心機（上海安亭儀器廠）；PHSJ-3F臺式酸度計（上海雷磁酸度計）；HHS-2S恒溫水浴鍋（上海虞龍儀器設備有限公司）；SPX-250B-Z型生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；BCD-185HFA型冰箱（澳柯瑪股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理方法

挑選一定量完好的新鮮大蒜，剝去外皮，即為蒜米，用1%次氯酸鈉溶液消毒30 min，取出用清水沖洗后吸去明水，擺放在墊有紗布的白瓷盤中，用去離子水或不同pH的緩沖液（檸檬酸-磷酸氫二鈉）浸漬淹沒蒜米，置于黑暗環境在一定溫度下培養一定時間。屆時將蒜米取出用吸水紙吸干表面液體，測定其GABA質量分數（鮮重）。

1.2.2 蒜米富集GABA的培養工藝試驗

首先對蒜米富集GABA的培養工藝進行單因素試驗，設定培養溫度20～35 ℃、培養時間0～60 h、緩沖液pH 4.6～6.2，測定蒜米中GABA質量分數。在單因素試驗的基礎上，根據正交試驗設計原理，對培養工藝的三因素進行優化，選出蒜米富集GABA的最佳培養工藝。

1.2.3 蒜米富集GABA的培養液中外源添加物試驗

為進一步提高蒜米中GABA質量分數，在最佳培養工藝的基礎上，在培養液中添加促進GAD活性的物質或GABA合成的底物。谷氨酸鈉（MSG）質量濃度設為 6～18 mg/mL；維生素B6（VB6）質量濃度設為0.01～0.04 mg/mL；CaCl2濃度設為1.0～4.0 mmol/L。所有溶液都由10 mmol/L的檸檬酸緩沖液配制而成，調節初始pH至5.8。根據Box-Behnken試驗設計原理，對外源添加物組分進行優化，確定最佳的培養液中外源添加物濃度。

1.3 GABA測定方法

將蒜米樣品進行充分磨碎，精確稱取1 g，參照白青云等[7]的方法，采用比色法測定樣品中GABA質量分數。

1.4 數據統計與分析

試驗進行3次重復，避免出現偶然因素影響試驗結果。采用Design Expert 8.0設計軟件處理試驗數據，并對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 培養工藝對蒜米中GABA質量分數的影響

2.1.1 培養溫度對蒜米GABA質量分數的影響

由圖1可見：蒜米在溫度20～35 ℃范圍內用去離子水培養36 h，培養溫度對蒜米中GABA質量分數有顯著影響，呈先上升后下降的趨勢。25 ℃時蒜米中GABA質量分數最高，為0.320 mg/g，分別比20 ℃時和35 ℃時提高43.50%和51.66%，說明在一定溫度范圍內，適宜的培養溫度促進蒜米中GABA質量分數增加，最適溫度為25 ℃。其原因是在一定溫度范圍內，適宜的培養溫度可以增強GAD的活性，進而促進蒜米中GABA質量分數增加。調節發芽溫度可以使糙米有效地富集GABA[8]，此次研究結果與其一致。

圖1 培養溫度對蒜米富集GABA的影響

2.1.2 培養時間對蒜米發芽富集GABA質量分數的影響

從圖2可以看出：蒜米在25 ℃去離子水培養0～60 h范圍內，蒜米中GABA質量分數呈先緩慢增加后急速降低的趨勢。培養48 h時GABA質量分數最高，為0.347 mg/g，是原料（0.143 mg/g）的2.43倍。因此，48 h是蒜米富集GABA的適宜時間。培養時間過短，GAD沒有得到充分的激活；培養時間過長，GABA則會因谷氨酸轉氨酶催化形成琥珀酸半醛[9]。

圖2 培養時間對蒜米富集GABA影響

2.1.3 培養液pH對蒜米中GABA質量分數的影響

蒜米在溫度20 ℃培養36 h，培養液pH對蒜米中GABA質量分數的影響見圖3。pH在4.6～5.8之間，GABA質量分數隨pH的升高而緩慢升高；pH在5.8～6.2之間時則相反。蒜米中GABA質量分數在pH 5.8時最高，為0.373 mg/g，比原料提高了160.84%。由此可知，培養液pH 5.8對蒜米富集GABA的效果最佳。蔣振暉等[10]研究發現，低酸性環境有利于激活GAD。此次研究也得出相似結論。

圖3 不同pH對蒜米富集GABA的影響

2.1.4 正交試驗法優化蒜米富集GABA的培養工藝

正交試驗優化的蒜米富集GABA的試驗設計和結果見表1。結果表明，蒜米富集GABA的最佳培養工藝為A1B1C2，即培養溫度為20 ℃、培養時間為36 h、培養液pH為5.8。由極差分析可知，培養液pH是最主要的影響因素，培養溫度次之，最后是培養時間。在最佳培養工藝下，蒜米中GABA質量分數為0.439 mg/g，是原料的3.07倍。

表1 蒜米富集GABA的培養工藝正交試驗結果

2.2 培養液中外源添加物對蒜米富集GABA的影響

2.2.1 MSG濃度對蒜米GABA質量分數的影響

由圖4可知：MSG在6～18 mg/mL濃度范圍內，蒜米中GABA質量分數隨著培養液中MSG濃度的增加呈先上升后下降趨勢。當MSG濃度為10 mg/mL時，GABA質量分數最高，為0.705 mg/g，是最優培養工藝下（0.439 mg/g）的1.61倍。MSG作為植物GAD的專一底物，可以促進GABA的合成[11]。南瓜籽培養液中添加MSG可以提高GABA的富集量[12]，此次研究結果與其一致。

圖4 MSG濃度對蒜米富集GABA的影響

2.2.2 CaCl2濃度對蒜米中GABA質量分數的影響

培養液中添加CaCl2對蒜米中GABA富集的影響見圖5。

圖5 CaCl2濃度對蒜米富集GABA的影響

CaCl2在1～4 mmol/L濃度范圍內，蒜米GABA質量分數呈現出先增加后降低的趨勢。當CaCl2濃度為3 mmol/L時，GABA富集量最高，為0.696 mg/g，比最優培養工藝下提高58.54%。GAD末端有一個鈣調素結合域，并且GAD活性由鈣離子（Ca2+）或CaM調節[13]，因此增加胞質Ca2+濃度可以刺激GAD活性，進而促進GABA質量分數增加。

2.2.3 VB6對蒜米GABA質量分數的影響圖6顯示：添加VB6能有效促進蒜米富集GABA。VB6在0.02 mg/mL時，蒜米中GABA質量分數最高，為0.679 mg/g，比最優培養工藝下提高54.67%。研究表明，VB6是GAD的輔基磷酸吡哆醛（PLP）的前體物質，有激活GAD達到富集GABA的作用[14]。

圖6 VB6濃度對蒜米富集GABA影響

2.2.4 蒜米富集GABA的外源添加物組分優化

Box-Behnken試驗設計的優化蒜米富集GABA的培養液中外源添加物組分方案和結果見表2。

表2 蒜米富集GABA的培養液中添加物濃度試驗方案和結果

運用Design Expert軟件，對表4數據進行二次多元逐步回歸擬合，得到蒜米富集GABA預測值的二次多項逐步回歸方程：

Y=-0.431 54+0.111 513X1+0.418 95X2+7.255 00X3+1.312 50E-003X1X2+0.337 50X1X3+0.900 00X2X3-6.489 06E-003X12-0.0743 25X22-305.750 00X32

運用方差分析上述回歸模型，模型的F=110.92，p＜0.000 1，因此該回歸模型是非常有效的，回歸模型的決定系數R2=0.993 0，說明模型具有良好的相關性，可用于指導實踐。

由表3可見：MSG的一次項和二次項對蒜米GABA質量分數有極顯著影響，CaCl2的二次項對蒜米中GABA質量分數有極顯著影響（p＜0.01），VB6的一次項和二次項對蒜米中GABA質量分數有顯著影響（p＜0.05）。MSG和VB6兩者的交互作用對蒜米富集GABA的影響顯著（p＜0.05）。

表3 回歸模型方差分析

在試驗設定的因素水平范圍內，根據回歸分析法所得的二次方程，得到交互作用影響顯著的兩變量之間二次回歸方程的響應曲面圖，見圖7。當CaCl2濃度為3.0 mmol/L時，在固定的MSG濃度下，GABA質量分數隨VB6濃度的增加呈先增加隨后緩慢下降的趨勢。當VB6濃度為0.029 mg/mL時，GABA富集量最大。當MSG濃度為10.17 mg/mL時，GABA質量分數最高。

圖7 MSG和VB6的交互作用對蒜米GABA質量分數影響的響應曲面圖

從Box-Behnken試驗結果得出，當培養液中MSG濃度為10.17 mg/mL、CaCl2濃度為3.02 mmol/L、VB6濃度為0.029 mg/mL時，蒜米富集GABA最高，此即為最佳培養液中外源添加物濃度。在此條件下蒜米中GABA富集量預測值為0.827 mg/g，通過驗證試驗，測得的實際值為0.832 mg/g，預測值與實際值高度相符，從側面證明所建立模型可靠，可以預測響應值和組分濃度之間的關系。在最佳培養液中外源添加物培養下，蒜米GABA的質量分數為最優培養工藝的1.90倍，是原料的5.81倍，說明培養液中添加了外源添加物后能顯著提高蒜米中GABA質量分數。

3 結論

采用正交試驗設計優化了蒜米富集GABA的最佳培養工藝，即培養溫度20 ℃、培養時間36 h，培養液pH 5.8，三因素的影響順序依次為培養液pH＞培養溫度＞培養時間，此時蒜米中GABA的富集量為0.439 mg/g，是原料的3.07倍。響應面優化的最佳培養液外源添加物濃度為MSG濃度10.17 mg/mL、CaCl2濃度3.02 mmol/L和VB6濃度0.029 mg/mL，此時蒜米中GABA質量分數為0.832 mg/g，是原料的5.81倍。由方差分析可知，MSG的一次項和二次項，CaCl2二次項，VB6的一次項和二次項以及MSG和VB6的交互作用均顯著影響蒜米中GABA質量分數。