響應(yīng)面法優(yōu)化無花果凍果果酒的發(fā)酵工藝

張鑫，季明月，任宏蕊，孟辰，檀建新，龔建剛*

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院（保定 071000）

無花果風(fēng)味獨特，口感甜美，含有豐富的纖維素、酚酸、類黃酮物質(zhì)[1-2]，以及鉀、鈣元素含量豐富的礦物質(zhì)[3-4]。無花果作為藥食同源之品，含有豐富的具有藥理作用和顯著臨床效果的化學(xué)成分[5]，常將其譽為21世紀(jì)人類健康的守護神[6]。

由于無花果屬于躍變型果實，鮮果成熟衰老迅速，易受病原體侵染，采后易腐爛，貯藏、運輸困難，為增加經(jīng)濟價值，將剛采收的無花果進行冷凍保存，可以有效抑制有害微生物的繁殖，有利于無花果營養(yǎng)的保留[7-8]。有研究表明，冷凍商品的維生素含量與新鮮商品的維生素含量相當(dāng)，有時甚至更高[9]。

高揚等[10]報道，波姬紅品種的無花果果實中果膠、單寧含量低且出汁率高，適合作為釀酒原料。目前有分別用無花果鮮果、無花果果干釀酒的相關(guān)報道[11-12]，在以冷凍保存果的釀制研究中，有以速凍藍(lán)莓果為主要原料的釀造藍(lán)莓果酒研究[13]，用鮮果和凍果釀造的紅樹莓酒進行比較的研究[14]，但鮮見用無花果凍果釀酒的研究。又因相比于葡萄酒的香氣，無花果釀造的果酒香氣較淡[15-16]。若充分利用非釀酒酵母和釀酒酵母的相互作用，進行混合發(fā)酵，可改善單一菌種發(fā)酵的局限性，豐富果酒口感和香氣[17]。宋照軍等[18]的研究也表明非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵所得無花果山楂復(fù)合果酒的感官評分最高。

故研究以凍藏的波姬紅品種的無花果為原料，采用能突出低溫發(fā)酵性能的BV818釀酒酵母和NSD產(chǎn)香酵母，使用響應(yīng)面法研究有機酸添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對無花果凍果果酒的發(fā)酵工藝的影響，為無花果的加工利用及工業(yè)化生產(chǎn)無花果凍果果酒提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無花果品種波姬紅凍果（保定沃盛無花果生態(tài)采摘園）；葡萄酒酵母NSD、BV818（安琪酵母有限公司）；檸檬酸、酒石酸、偏重亞硫酸鉀、蔗糖（食品級）。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-300-X電子天平（廈門百倫斯電子科技有限公司）；HH-4恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；STARTER 3100 pH計（上海奧豪斯儀器有限公司）；SPX-250B-Z恒溫發(fā)酵箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；MJ-BL 25B3多功能榨汁機（廣東美的電器有限公司）；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 無花果凍果果酒的加工工藝流程及操作要點

鮮無花果→挑選→去梗→凍藏→破碎→無花果漿→調(diào)糖→加酸→添加酵母→發(fā)酵→過濾→后發(fā)酵→虹吸過濾→陳釀→成品

無花果漿的制備：選取無腐爛的無花果凍果，將其破碎成漿。無花果漿的總糖為122.99 g/L，總酸為2.44 g/L。

調(diào)糖：糖度是影響酵母發(fā)酵、酒精度及果酒口感的重要因素。添加一定量的蔗糖于無花果果漿汁中，控制糖含量在200 g/L。

加酸：無花果釀造的酒中酸度不足，為達(dá)到酒品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，需外加有機酸對成分進行調(diào)整。

活化及添加酵母：分別將釀酒酵母BV818、產(chǎn)香酵母NSD與稀釋后的無花果汁（無花果汁與水體積比為1∶2）按1∶10（g/mL）的比例配成混合液，調(diào)溫至35～40 ℃，靜置活化20 min。活化后的兩種酵母均按0.15%接種量加入果漿中。

陳釀：取發(fā)酵上清液，在4 ℃條件下陳釀30 d，使酒味協(xié)調(diào)，風(fēng)味更加突出。

1.3.2 無花果凍果果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

外源有機酸比例：按照1.3.1方法制備若干份無花果凍果漿，分別加入有機酸，即酒石酸+檸檬酸1∶1，1∶2和2∶1。在發(fā)酵溫度20 ℃、發(fā)酵時間6 d、兩種酵母添加量均為0.15%的條件下，分別考察有機酸種類對果酒發(fā)酵的影響。

外源有機酸添加量：按照1.3.1方法制備若干份無花果凍果漿，分別加入0，1，2，3和4 g/L的有機酸，在發(fā)酵溫度20 ℃、發(fā)酵時間6 d、兩種酵母添加量均為0.15%的條件下，考察有機酸添加量對果酒發(fā)酵的影響。

發(fā)酵溫度：按照1.3.1方法制備若干份無花果凍果漿，在發(fā)酵時間6 d、有機酸添加量2 g/L、兩種酵母添加量均為0.15%的條件下，考察發(fā)酵溫度（18，20，22，24和26 ℃）對無花果凍果果酒的影響。

發(fā)酵時間：按照1.3.1方法制備若干份無花果凍果漿，在發(fā)酵溫度20 ℃、有機酸添加量2 g/L、兩種酵母添加量均為0.15%的條件下，考察發(fā)酵時間（2，4，6，8和10 d）對無花果凍果果酒的影響。

1.3.3 無花果凍果果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

利用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝，以有機酸添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）為自變量，以感官評分（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，進行三因素三水平的優(yōu)化設(shè)計，Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 無花果凍果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平

1.3.4 無花果凍果果酒的品質(zhì)分析

1.3.4.1 感官評定

依據(jù)GB 15037—2006《葡萄酒》[19]制定出無花果凍果果酒的感官評分標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)10位經(jīng)過培訓(xùn)的人員（男∶女=1∶1）的感官品嘗，從香氣、色澤、口感、典型性四個方面對無花果凍果果酒進行感官評分，滿分100分，評分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 無花果凍果果酒感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4.2 理化指標(biāo)

采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]中的方法測定總糖、總酸（以檸檬酸計）、酒精度。

1.3.5 統(tǒng)計分析方法

做3次平行測定，采用Origin 2018 Pro繪圖、Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面分析以及SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源有機酸比例的確定

果酒中的有機酸是重要的呈味物質(zhì)，并且可促進果酒的老熟和澄清[21]。但無花果中有機酸含量較低，需要外加酸來豐富果酒風(fēng)味和提高穩(wěn)定性，一般添加酒石酸和檸檬酸來使果酒中有機酸含量增多[22]。由表3可知，選用酒石酸和檸檬酸添加質(zhì)量比1∶2時感官評分最高。

表3 外源酒石酸與檸檬酸比例對無花果凍果果酒發(fā)酵的影響

2.2 有機酸添加量對果酒發(fā)酵的影響

果酒中有機酸過高會影響酵母的活性，并在發(fā)酵結(jié)束后使果酒揮發(fā)酸增加，影響成品酒的口感[23]，過量揮發(fā)酸會導(dǎo)致果酒風(fēng)味粗糙，適量的有機酸則會協(xié)調(diào)合適的酒精度，可使果酒的典型性更加突出。

由圖1可知，隨著有機酸添加量的增加，酒精度變化不明顯，當(dāng)有機酸添加量為2 g/L時達(dá)到最高，而后下降，可能是由于酸度的變化改變了營養(yǎng)物質(zhì)分子的電離狀態(tài)，降低了它們被酵母利用的程度，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物乙醇的含量降低。在加酸量在0～2 g/L時，果酒感官評分逐漸升高，當(dāng)加酸量達(dá)到2 g/L時果酒感官評分最高，為91.50±0.71分，當(dāng)外加酸量增加至4 g/L時，果酒感官評分顯著下降至78.33±0.47分。這可能是由于當(dāng)加酸量達(dá)到2 g/L時，有機酸與合適的酒精協(xié)調(diào)使果酒口感和風(fēng)味達(dá)到最佳。當(dāng)外加酸量繼續(xù)增加，大量檸檬酸在蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中被消耗而轉(zhuǎn)化生成揮發(fā)酸，酒石酸被乳酸菌降解也導(dǎo)致?lián)]發(fā)酸增加。因此，果酒發(fā)酵最佳加酸量為2 g/L。

圖1 有機酸添加量對無花果凍果果酒發(fā)酵的影響

2.3 發(fā)酵溫度對果酒發(fā)酵的影響

考察發(fā)酵溫度對果酒感官評分的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對無花果凍果果酒發(fā)酵的影響

由圖2可知，酒精度隨著溫度升高而逐漸升高。發(fā)酵溫度在18～20 ℃范圍內(nèi)，感官評分與溫度呈正相關(guān)，在20～26 ℃范圍內(nèi)，感官評分與溫度呈負(fù)相關(guān)。感官評分在20 ℃時達(dá)到最高，為90.8±0.16分，之后隨著發(fā)酵溫度的升高，其感官評分逐漸降低。由于非釀酒酵母可以通過酶活性影響果酒品質(zhì)特征[24]，溫度的變化可能引起其代謝產(chǎn)物的改變。溫度在20～26 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，一方面易揮發(fā)的香氣成分更易逸出，導(dǎo)致酒香不足，另一方面，酵母的自身生長繁殖加快、代謝作用加強，消耗大量糖類物質(zhì)的同時，代謝副產(chǎn)物增加，酵母的老化過程被加快，自溶現(xiàn)象明顯增加，最終影響果酒的香氣、口感等感官評價指標(biāo)。因此，果酒發(fā)酵的最佳溫度是20 ℃。

2.4 發(fā)酵時間對果酒發(fā)酵的影響

發(fā)酵時間是影響果酒品質(zhì)的重要因素。發(fā)酵時間短，無法成就果酒的典型性，發(fā)酵時間長會導(dǎo)致酒的口感變差，時間過長甚至?xí)懈瘮∽儔牡暮蠊鸞25]。考察發(fā)酵時間對果酒感官評分的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵時間對無花果凍果果酒發(fā)酵的影響

由圖3可知，酒精度隨發(fā)酵時間延長呈上升趨勢，但在第10天有所下降，原因可能是隨著時間延長，乙醇被其他微生物例如醋酸菌代謝而轉(zhuǎn)化成醋酸。感官評分在發(fā)酵時間2～6 d范圍內(nèi)增加，并且在第6天達(dá)到最高，為90.23±0.56分，在第6天之后感官評分降低。低溫發(fā)酵的缺陷是發(fā)酵周期長，一方面低溫減緩了酵母的生長繁殖速度，另一方面，低溫環(huán)境下的酵母具有不同的代謝途徑[26]。所以當(dāng)?shù)蜏匕l(fā)酵且發(fā)酵時間短時，可能由于發(fā)酵不充分、代謝產(chǎn)物的改變而影響果酒的品質(zhì)。從第6天開始，隨著時間的延長，可能是由于污染了發(fā)酵液的醋酸菌將乙醇轉(zhuǎn)化成了乙酸，導(dǎo)致果酒酸澀味增強，協(xié)調(diào)性變差。此外，時間過長也可能使得酵母的自溶率增加，這可能使得果酒的渾濁度增加，感官評分下降。因此，果酒最佳發(fā)酵時間是6 d。

2.5 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面模型建立及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件進行分析，以感官評分（Y）作為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果見表4。對模型進行回歸分析，分析結(jié)果見表5。

表4 無花果凍果果酒發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果

對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到A（有機酸添加量）、B（發(fā)酵溫度）、C（發(fā)酵時間）與感官評分（Y）的二次多項回歸方程：Y=93.30-1.21A-1.51B-1.03C-0.73AB+0.45AC-1.45BC-4.19A2-2.99B2-1.86C2。

由表5可知：模型的p＜0.000 1，達(dá)到極顯著，說明響應(yīng)面法得到的模型可靠；失擬項p值為0.577 6＞0.05，表明失擬性檢驗結(jié)果不顯著，沒有失擬現(xiàn)象；決定系數(shù)R2=0.986 9，調(diào)整決定系數(shù)Radj2=0.970 1，說明模型可解釋98.69%的可變性，說明回歸模型擬合程度高，可以應(yīng)用于無花果凍果果酒釀造工藝研究的理論預(yù)測。交互項AC對結(jié)果影響不顯著（p＞0.05）。一次項A、B、C，交互項AB、BC，二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（p＜0.01）。由F值可知，各因素對感官評分的影響從大到小依次是B（發(fā)酵溫度）＞A（有機酸添加量）＞C（發(fā)酵時間）。

表5 回歸模型方差分析及顯著性檢驗

2.5.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

A（有機酸添加量）、B（發(fā)酵溫度）、C（發(fā)酵時間）3個因素之間交互作用的響應(yīng)面及等高線見圖4。圖4（a）和圖4（b）的曲面坡度較平緩，等高線較圓，而由圖4（c）可以看出，響應(yīng)面的曲面坡度較陡，等高線偏橢圓，說明BC之間的交互作用比AB之間、AC之間的交互作用強。

圖4 有機酸添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間交互作用對無花果凍果果酒感官評分影響的響應(yīng)面及等高線

2.5.3 響應(yīng)面驗證試驗

通過回歸模型的預(yù)測得到無花果凍果果酒的最佳發(fā)酵工藝：有機酸添加量1.86 g/L，發(fā)酵溫度19.64℃，發(fā)酵時間5.56 d。此時感官評分的理論值為93.64分。為了便于實際操作，將發(fā)酵工藝參數(shù)修正為加酸量1.9 g/L，發(fā)酵溫度19.5 ℃，發(fā)酵時間5.5 d。在此優(yōu)化條件下，果酒酒精度為6.2%vol，感官評分實際值為93.50分，試驗值與預(yù)測值的差異不明顯，證明該模型預(yù)測的工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采取響應(yīng)面法進行工藝優(yōu)化，確定無花果凍果果酒工藝最佳工藝參數(shù)：選用的有機酸為酒石酸+檸檬酸（1∶2），有機酸添加量1.9 g/L，發(fā)酵溫度19.5 ℃，發(fā)酵時間5.5 d。此優(yōu)化條件下得到的果酒酒精度為6.2%vol，感官評分為93.50分，所得的無花果凍果果酒色澤橙黃且透明，果香濃郁，口感酸甜協(xié)調(diào)，典型性強。