高濃度CO2氣調包裝對冷藏草魚品質的影響

程智蓁，張雙其，楊慶倫，應曉國，于瑾*，胡金春*

1. 浙江海洋大學食品與藥學學院（舟山 316022）；2. 浙江龍和水產養殖開發有限公司（衢州 324400）；3. 龍游縣養殖業發展中心（衢州 324400）；4. 衢州市水產技術推廣中心（衢州 324400）

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是世界上最重要的淡水魚類之一，具有生長速度快、養殖方便、飼料利用率高、價格低廉、營養價值高等特點。根據2020年《中國漁業統計年鑒》[1]統計，2019和2018年草魚的養殖產量在所有淡水養殖魚類中均為最高，分別為5 533 083 t和5 504 301 t，2019年比2018年同比增長0.52%。草魚市場需求量巨大且每年仍在不斷增長，廣受消費者歡迎。但是草魚肉極易發生腐敗，這是一個復雜的過程，涉及內外多種因素。主要分為兩方面：一方面是由于草魚肉的酸堿度為中性，蛋白質含量高，及魚體內的酶促自溶；另一方面是由于微生物的作用而導致魚肉品質下降，并伴有揮發性氣味物質的變化。

氣調包裝是水產品保鮮技術之一，其采用具有氣體阻隔性包裝材料，將食品密封于一定比例的混合氣體環境中，改變包裝內食品的氣體環境，從而達到抑菌及延長食品貨架期的目的[2]。CO2能有效抑制微生物，特別是需氧微生物在對數生長期的生長速率。Sivertsvik等[3]總結CO2對細菌作用的4種機制：改變細胞膜功能（包括影響營養物質吸收）、直接抑制酶或降低酶反應速率、穿透細菌膜導致細胞內pH變化和直接改變蛋白質的理化性質。低溫對微生物的生長有延緩作用，由于低溫對微生物的直接作用的同時也能更好地溶解二氧化碳，如謝晶等[4]研究發現不同體積分數CO2氣調包裝中，80% CO2組的保鮮效果最佳，能有效延長凡納濱對蝦的冷藏貨架期至8 d。高海[5]研究得出不同CO2、O2氣體濃度包裝方式對草魚、三文魚均能起到較好的保鮮鮮果，且起抑菌作用的主要為60%CO2，但有關高濃度CO2氣調包裝對草魚的貯藏保鮮研究報道較少。

因此，以新鮮草魚為研究對象，在100%體積分數的CO2氣調冷藏條件下測定草魚的微生物、各項理化指標及觀察微觀組織結構等的變化。研究高濃度CO2氣調包裝對草魚冷藏過程中的品質影響，以期為高濃度CO2氣調保鮮在草魚等水產品中的應用、提高草魚資源的利用率方面提供理論。

1 材料與方法

1.1 原料

新鮮活草魚（購于舟山菜籃子市場，個體質量1.5～2.0 kg，原料運回實驗室不超過30 min）。

1.2 主要儀器設備

SW-CJ-1F型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；KDN-520型全自動凱氏定氮儀（邦億精密量儀上海有限公司）；CR-10型色差儀（日本柯尼卡美能達公司）；HHS-21-4電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司）；CF-16RN高速冷凍多用途離心機（日本日立公司）；FSH-2高速可調勻漿機（武漢格萊莫檢測設備有限公司）；生物組織自動包埋機（湖北貝諾醫療科技有限公司）；ECLIPSE E100顯微鏡（NIKON）。

1.3 方法

1.3.1 原料處理及包裝

鮮活草魚，宰殺清洗去鱗、去內臟，分別取背部和腹部魚肉，將魚肉切塊（魚塊質量35.0±0.5 g）后裝入聚乙烯（PE）保鮮袋封裝。魚肉分成2組，1組為空氣組，另外1組為100% CO2氣調包裝組。將魚塊裝入PE包裝袋后，真空充氣包裝機抽真空，利用鋼瓶裝CO2（純度均為99.999 9%）通過配氣裝置進行配氣，由進氣口通入CO2氣體，尾氣直接排入空氣中，包裝好的魚肉塊放置于4 ℃冷藏。4 ℃貯藏期間，分別在0 d于（宰殺后未包裝的鮮魚）、0 d CO2氣調處理及儲藏1，3，5和7 d的樣品測定相關指標。

1.3.2 菌落總數測定

按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[6]進行測定。

1.3.3 TVB-N含量測定

按照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》[7]，利用全自動凱氏定氮儀法進行測定，每組重復3次，取平均值。

1.3.4 色差的測定

打開包裝袋取出樣品，將樣品置于光源下，保持每次測定均在同一光源下進行。色差計經校準后，測定樣品的色差值L*（亮度值）、a*（紅度值）、b*（黃度值），每組對6個樣品的外表面與正反兩面進行測定取平均值。按照式（1）計算色差值（ΔE），分析色澤總變化。

式中：L0*、a0*、b0*分別為未包裝處理魚肉的亮度、紅度和黃度值。

1.3.5 水分測定按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》[8]，每組重復3次，取平均值。

1.3.6 汁液損失率測定

包裝前將草魚塊進行稱質量并記下初始質量，記為m0；試驗時將草魚塊從包裝中取出，用濾紙吸干表面水分后稱質量，記為m1，每組重復3次，取平均值，計算如式（2）所示。

1.3.7 持水率測定

按Liu等[9]的方法稍作修改。稱取5.0±0.5 g魚肉，記為w1。用3層濾紙包裝，放入50 mL離心管中，離心管底部放一團棉花。在4 ℃、5 000 r/min離心10 min后稱其質量，記為w2。每組樣品重復3次，求平均值，計算如式（3）所示。

1.3.8 蒸煮損失率測定

準確稱取20 mm×20 mm×10 mm肉樣，裝入蒸煮袋中封好，在恒溫水浴中加熱至肉樣中心溫度至75 ℃，取出冷卻至室溫。用吸水紙吸干表面汁液后進行稱量，每組樣品重復3次取平均值，計算如式（4）所示。

式中：m2為蒸煮前魚肉質量，g；m3為蒸煮后魚肉質量，g。

1.3.9 微觀組織結構觀察

從樣品中心部位順纖維方向取3 mm厚，橫截面約為5 mm×5 mm的樣品，迅速投入4%多聚甲醛固定液中。固定后的樣品石蠟切片脫蠟至水，依次將切片放入二甲苯Ⅰ 8 min-二甲苯Ⅱ 8 min-甲苯Ⅲ 8 min-無水乙醇Ⅰ 5 min-無水乙醇Ⅱ 5 min-85%酒精5 min-75%酒精5 min，自來水洗2 min；蘇木素染色5 min，鹽酸水溶液分化2 s，氨水水溶液返藍15～30 s，水洗切片入95%的酒精脫水，入伊紅染液中染色5～8 s。切片依次放入無水乙醇Ⅰ 30 s-無水乙醇Ⅱ 2.5 min-無水乙醇Ⅲ 2.5 min-二甲Ⅰ 2.5 min-二甲苯Ⅱ 2.5 min透明，中性樹膠封片。用ECLIPSE E100顯微鏡放大100倍觀察，圖像采集分析。

1.4 數據分析與處理

所有數據至少重復3次，數據以平均值及方差表示。數據處理及作圖采用OriginPro 9.1，SPSS 13.0統計分析軟件。

2 結果與分析

2.1 菌落總數變化

水產品的腐敗主要是由微生物作用引起的，菌落總數可以較好地反映魚的腐敗程度。由圖1可以看出，隨著貯藏時間延長，不同包裝處理的草魚菌落總數均呈增長趨勢。草魚的初始菌落為4.49 lg（CFU/g）。貯藏前期，菌落總數上升較為緩慢，這可能由于微生物還處在適應階段，而第5～第7天微生物上升速度變快。根據《微生物檢驗與食品安全控制》國際食品微生物規格委員會規定[10]，魚的菌落總數可接受水平限量值為5.69 lg（CFU/g），最高安全限量值為6.00 lg（CFU/g）。在第7天空氣組的菌落總數達到6.21 lg（CFU/g），超過最高安全限量，而CO2處理組的菌落總為5.08 lg（CFU/g），在可接受水平內。另外，在整個貯藏期間CO2處理組的菌落總數也始終低空氣組，說明CO2能夠有效抑制微生物的生長繁殖，從而改善草魚的魚肉品質。

圖1 草魚在4 ℃氣調包裝貯藏期間菌落總數的變化

2.2 TVB-N值變化

TVB-N值是食品腐敗的直觀反映指標，與魚類內源酶活性和微生物生長呈正相關。TVB-N值越大表明腐敗程度越嚴重。從圖2可以看出，在整個冷藏過程中，氣調組的TVB-N值上升速度得到延緩，而空氣組草魚片的TVB-N值上升較快。空氣組第0天，即新鮮草魚片的TVB-N值為11.20 mg/100 g，0 d處理氣調組的TVB-N值為10.92 mg/100 g。TVB-N≤13 mg/100 g為一級鮮度；TVB-N≤20 mg/100 g為二級鮮度。在冷藏第5天時氣調組草魚片的TVB-N值為12.60 mg/100 g，為一級鮮度，而空氣組的TVB值達到18.43 mg/100 g，為二級鮮度。在冷藏第7天時氣調組的TVB-N值為12.68 mg/100 g，幾乎維持不變，仍維持在一級鮮度水平，而空氣組的TVB-N值仍在上升，到第7天時達到29.17 mg/100 g，超過GB 2733—2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》[11]規定的淡水魚TVB-N限量值（≤20 mg/100 g），已不可食用，這與菌落總數結果一致。試驗數據表明，高濃度CO2氣調處理可以有效延緩TVB-N的增長速率，抑制草魚片的腐敗，從而延長草魚片的貨架期。這可能與氣調包裝中充入的CO2氣體能夠有效抑制大多數微生物的生長代謝，從而延緩因細菌生長繁殖導致的食品蛋白質分解而產生的氨及胺類等堿性含氮揮發性物質的產生有關[12]。

圖2 草魚在4 ℃氣調包裝貯藏期間TVB-N值的變化

2.3 色差變化

草魚的色差變化是影響消費者可接受性的一個主要因素，在挑選產品時色澤也是最直觀的原因之一。L*越大，表示越白；a*為正值表示偏紅，負值表示偏綠；b*為正值表示偏黃，負值表示偏藍；ΔE表示樣品顏色的變化。盡管在試驗過程中獲得的L*（亮度值）、a*（紅度值）、b*（黃度值）沒有表現出顯著的變化趨勢，但是草魚的色差值（ΔE）具有一定的變化趨勢。色差值（ΔE）1.5～3.0為感覺到有點差異；3.0～6.0為顯著性差異[13]。由圖3可以得出，在第3天時氣調組的色差為1.99，而空氣組的色差值達到4.77，表現為顯著差異。色差值（ΔE）6.0～12.0為極顯著差異。在第7天時空氣組的色差值為7.70，表現為極顯著差異，而氣調組的色差值為4.76，表現為顯著差異水平。草魚色差值（ΔE）呈逐漸升高趨勢，這可能是由于在貯藏過程中魚肉中蛋白質、脂質被氧化分解，蛋白發生變性，從而使魚肉表面顏色發生改變。氣調組的色差值在貯藏過程中低于空氣組，表明高濃度的CO2能夠在一定程度上抑制魚肉的色澤發生變化，使草魚保持較好的品質。這可能是由于CO2氣調包裝中缺少氧氣，草魚肌肉中的相關物質不能氧化所致。

圖3 草魚在4 ℃氣調包裝貯藏期間色差值的變化

2.4 水分變化

水分的高低直接影響食品的感官和口感[14]，反映新鮮度。由圖4可知，新鮮草魚的水分為77.92%，這與王雪峰等[15]的研究結果相似。隨著貯藏時間延長，樣品水分呈現下降趨勢，空氣組和氣調組的降低程度分別為33.0%和10.6%。在貯藏第7天時空氣組的水分明顯下降為52.16%，明顯低于CO2氣調組的水分，為69.65%，貯藏過程中氣調組的水分始終高于空氣組，且下降速率低于空氣組。其中的原因可能是酶反應與微生物生長繁殖需要大量水分，以及隨著草魚新鮮度下降使得魚肉持水力下降，肌肉水分逐漸降低，而氣調組中的CO2能夠抑制部分微生物的生長，從而降低水分的需求量。這說明高濃度CO2處理能夠有效抑微生物的繁殖和水分的喪失，改善冷藏過程中草魚的保水性。

圖4 草魚在4 ℃氣調包裝貯藏期間水分的變化

2.5 汁液損失率變化

汁液損失率反映魚體貯藏期間汁液的流失狀況，汁液流失導致肉質的口感變差，產品變暗或無光澤，營養大量流失。由圖5可以看出，空氣組與CO2氣調組的汁液損失率均呈上升趨勢。空氣組和氣調組的汁液損失率分別從第0天的0.17%和0.36%上升到第7天的6.44%和5.58%。這是由于草魚品質的劣變，使持水力下降，從而導致汁液流出。在冷藏前5 d時CO2氣調組的汁液損失率總是高于空氣組。這可能是因為在冷藏過程中CO2氣體溶解于草魚肉中，使得魚肉蛋白質分子多肽鏈結合更為緊密，分子間距縮小，從而導致魚肉持水力減弱，汁液流失。同時大量的CO2與草魚表面流失的水分相溶，改變細胞膜的通透性，使細胞質大量滲出。在第7天時CO2處理組的汁液損失率低于空氣組，并且上升速率延緩，這可能是CO2抑制微生物的生長繁殖，使得抑制脂肪與蛋白質的氧化變性作用要強于CO2溶于魚肉所引起的汁液損失率，從而較好地維持草魚品質。

圖5 草魚在4 ℃氣調包裝貯藏期間汁液損失率的變化

2.6 持水率變化

持水力表示在一定外力作用下，樣品束縛自身或外加水分的能力[16]，魚肉的嫩度和口感與持水力密切相關，當持水力下降時肉質也隨之變硬，口感變差。如圖6所示，隨著冷藏時間延長，草魚的持水力呈下降趨勢。這是因為新鮮草魚的肌肉組織和肌原纖維排列緊密且均勻，隨著冷藏時間延長，魚肉肌原纖維之間的空隙不斷增加，同時組織結構發生斷裂，保水性變差，因此持水力不斷下降。在第0天時草魚的持水率為76.8%，這與Liu等[9]的研究結果相似，CO2氣調組的持水率為78.2%。在冷藏第7天時空氣組和CO2氣調組的持水力為58.13%和72.92%，它們的減少量分別為24.31%和6.75%。在整個周期中CO2氣調組的持水率始終高于空氣組。在第5～第7天的冷藏過程中，空氣組的持水率急劇下降，而CO2氣調組的下降速率已經開始延緩。這可能是因為冷藏期間，在魚體內源酶與外源微生物發生共同作用下，魚肉蛋白質降解，同時蛋白質的氧化不斷發生，導致持水力下降。而CO2氣調組使魚體處于無氧條件，減緩蛋白質氧化速率和微生物生長繁殖，說明CO2氣調處理的草魚肉對其持水能力具有積極作用。

圖6 草魚在4 ℃氣調包裝貯藏期間持水率的變化

2.7 蒸煮損失率變化

蒸煮損失率是衡量肉制品熟制前后質量減少程度的重要指標。由圖7得知，空氣組的蒸煮損失率呈上升趨勢，由第0天的24.39%上升到第7天的28.79%，且在冷藏0～7 d的過程中上升速率不斷變大。原因可能是隨著貯藏時間延長，微生物不斷繁殖增長，蛋白質被降解，魚肉的完整性受到破壞，使得蒸煮損失率上升。菌落總數的相似趨勢也印證了這一說法。CO2氣調處理組的蒸煮損失率呈不斷下降的趨勢，由第0天的23.76%下降至20.2%，且第5～第7天的下降趨勢延緩。這可能是因為部分物質與水分的流失，同時蛋白質的溶解性也與蒸煮損失密切相關。蛋白質變性過程中特定的空間結構被破壞，生物學活性喪失，因而更易被蛋白酶催化水解，使得溶解度降低，蒸煮損失率上升。CO2氣調組前期相較于空氣組有較高的汁液損失率，因而在蒸煮過程中的汁液流失的較少，蒸煮損失率便較低。由于CO2氣體對部分微生物生長活動的抑制作用，蛋白質的變性與水分的消耗逐漸減少，因此第5～第7天的變化延緩，這也與TVB-N值第5～第7天的趨勢相吻合。

圖7 草魚在4 ℃氣調包裝貯藏期間蒸煮損失率的變化

2.8 微觀組織結構變化

草魚的微觀組織結構可以反映其品質的變化。圖8顯示冷藏過程中草魚橫斷面在100倍光學顯微鏡下的肌纖維形態。第0天新鮮組的草魚的肌纖維膜狀態良好，細胞結構完整。肌纖維之間的邊界清晰且排列緊密整齊，間隙較小。隨著貯藏時間的增加，空氣組與CO2氣調組草魚的肌纖維間隙都不斷增大，且肌肉表面結構變得疏松、破碎。第7天空氣組可以明顯看出肌肉細胞出現空洞，肌纖維的間隙增大、排列不均勻，與肌節分離，碎片數量多。對比空氣組和CO2氣調組可以看出，CO2氣調組的肌纖維間隙較小，破裂程度低，組織狀態更完整、致密。這可能與原纖維蛋白在微生物和酶的作用下降解變性有關，并且隨著貯藏時間延長及微生物的生長代謝，氧化作用持續增強使得蛋白不斷降解，組織結構開始松散。試驗結果表明，CO2氣調處理可以有效減緩蛋白質的氧化變性，從而較好地維持草魚的肌肉結構。

圖8 不同包裝方式對草魚橫斷面微觀結構變化的影響（100×）

3 結論

通過空氣與100% CO2氣調包裝草魚并測定菌落總數、揮發性鹽基氮（total volatile basis nitrogen，TVB-N）含量、色差、水分、汁液損失率、持水率和蒸煮損失率等指標及觀察微觀組織結構，結果表明，在相同的貯藏時間里，高濃度CO2氣調包裝處理組無論是在微生物指標還是理化指標及微觀組織結構方面都要優于空氣組。隨著冷藏時間延長，草魚的菌落總數、TVB-N值、色差值、汁液損失率均呈上升趨勢，而CO2氣調包裝組整體值低于空氣包組，且上升趨勢較為緩慢。尤其是在冷藏第7天時，空氣組的TVB-N值為29.17 mg/100 g，發生腐敗變質，而氣調組TVB-N值為12.68 mg/100 g，仍維持在一級鮮度水平。另外，在貯藏過程中，水分與持水率呈下降趨勢，CO2氣調包裝組整體值高于空氣包組，下降較為緩慢。結果表明，高濃度的CO2可以有效抑制草魚體內大多數微生物的生長繁殖，延緩草魚中蛋白質的氧化變性，保持良好的色澤及肌肉品質，從而改善草魚的貯藏品質。總之，冷藏結合氣調包裝技術能有效延緩水產品變質，尤其是高濃度CO2氣體能夠有效延長草魚肉貨架期。