紅棗富硒乳酸菌飲料的生產(chǎn)工藝

賀佳璇，楊欣，徐穎*，許牡丹

陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院（西安 710021）

紅棗是鼠李科植物的成熟果實，富含維生素以及鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)[1-2]。紅棗除鮮食外，可加工成多種制品，目前紅棗的加工處于初級階段，技術(shù)含量較低，精深加工的紅棗產(chǎn)品較少，產(chǎn)品附加值偏低[3]。

飲食中添加硒，在國際上已受到廣泛重視和認(rèn)可[4]。食用有富硒乳酸菌的發(fā)酵食品，能達(dá)到補(bǔ)充人體每日所需硒元素的目的[5]。乳酸菌飲料是一類有發(fā)展?jié)摿Φ氖称罚驗樘砑映Ｒ娙樗峋L(fēng)味獨特，賦予飲料新的營養(yǎng)價值和保健功能[6-7]。利用乳酸菌制備獼猴桃乳酸菌飲料、石榴乳酸菌飲料和西瓜發(fā)酵乳飲料等，充分發(fā)揮了乳酸菌的優(yōu)勢，對豐富乳類飲品的市場和提升其經(jīng)濟(jì)價值都具有非常重要的意義[8-10]。

試驗利用具有富硒能力的兩株乳酸菌制備紅棗富硒乳酸菌飲料，確定白砂糖接種量、紅棗汁添加量、菌液接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的比例范圍。運(yùn)用D-最優(yōu)混料設(shè)計對配方進(jìn)行設(shè)計并進(jìn)行試驗，分析優(yōu)化結(jié)果選擇最佳組合配方，為富硒乳酸菌飲料的研發(fā)提供理論及實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大荔冬棗，雨潤農(nóng)副產(chǎn)品采購中心，無損傷，成熟度一致；嗜熱鏈球菌（BNCC 335885）、保加利亞乳桿菌（ZK-GIM 1.155），由實驗室提供；亞硒酸鈉，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；MRS培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為常見分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IRIS Intreid II電感耦合等離子發(fā)射光譜（美國Thermofisher公司）；FB-110X高壓均質(zhì)機(jī)（上海勵途機(jī)械設(shè)備有限公司）；G030-7071榨汁機(jī)（國華電器有限公司）；722E型分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；HPPL3-600/3型超高壓設(shè)備（天津市華泰淼淼生物工程技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 生產(chǎn)工藝流程

1.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

將活化好的乳酸菌接種于含亞硒酸鈉的液體MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，以4 000 r/min離心5 min。菌體用無菌生理鹽水洗滌3～4次，生理鹽水重懸并調(diào)整菌數(shù)為1×109CFU/mL，制成菌懸液備用。

1.3.2.1 單因素試驗

以白砂糖、紅棗汁（料液比1∶3）、菌液接種量（菌液比1∶1）、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度作為自變量，以總糖、總酸、總酚和感官評定作為評價指標(biāo)，確定各成分的比例范圍。

1) 白砂糖添加量對紅棗富硒乳酸菌飲料的影響。在脫脂奶粉（g）與水（mL）比例12%、紅棗汁添加量70%、菌液接種量3%、發(fā)酵時間36 h和發(fā)酵溫度37 ℃的條件下，白砂糖添加量分別為0，2%，4%，6%和8%，考察白砂糖添加量對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響。

2) 紅棗汁添加量對紅棗富硒乳酸菌飲料的影響。在白砂糖添加量4%、脫脂奶粉（g）與水（mL）比例12%、菌液接種量3%、發(fā)酵時間36 h和發(fā)酵溫度37 ℃的條件下，紅棗汁添加量分別為40%，50%，60%，70%，80%和90%，考察紅棗汁添加量對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響。

3) 菌液接種量對紅棗富硒乳酸菌飲料的影響。在白砂糖添加量4%、脫脂奶粉（g）與水（mL）比例12%、紅棗汁添加量70%、發(fā)酵時間36 h和發(fā)酵溫度37 ℃的條件下，菌液接種量分別為1%，2%，3%，4%，5%和6%，考察菌液接種量對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響。

4) 發(fā)酵時間對紅棗富硒乳酸菌飲料的影響。在白砂糖添加量4%、脫脂奶粉（g）與水（mL）比例12%、菌液接種量3%、紅棗汁添加量70%和發(fā)酵溫度37 ℃的條件下，發(fā)酵時間分別為6，12，18，24，36和48 h，考察發(fā)酵時間對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響。

5) 發(fā)酵溫度對紅棗富硒乳酸菌飲料的影響。在白砂糖添加量4%、脫脂奶粉（g）與水（mL）比例12%、菌液接種量3%、發(fā)酵時間36 h和紅棗汁添加量70%的條件下，發(fā)酵溫度分別為36，38，40，42，44和46 ℃，考察發(fā)酵溫度對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響。

1.3.2.2 D-最優(yōu)混料試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗得到紅棗汁、白砂糖和菌液各成分的比例范圍，以感官評定為指標(biāo)，利用D-最優(yōu)混料設(shè)計對乳酸菌飲料配方進(jìn)行試驗設(shè)計。應(yīng)用Design-Expert 8.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，選出預(yù)測模型并得到回歸方程。

1.3.2.3 紅棗汁添加量、白砂糖添加量和菌液接種量三種因素交互影響分析

在D-最優(yōu)混料設(shè)計試驗中，各因素的變化對指標(biāo)的影響可以通過響應(yīng)面圖和等高線圖反映。

1.3.2.4 配方的優(yōu)化及驗證試驗

利用軟件進(jìn)行優(yōu)化，得到組合配方，分析優(yōu)化結(jié)果選擇最佳配方。對配方進(jìn)行驗證試驗，判斷試驗值與預(yù)測值的符合度。

1.3.2.5 指標(biāo)及檢測方法

總酸測定，直接滴定法。總糖測定，斐林試劑法。總酚測定，F(xiàn)olin-Ciocalteu法。感官評定，感官評分組由15位感官評價員組成，對每份樣品進(jìn)行感官分析評定，每位評定小組成員進(jìn)行過至少一次感官評定培訓(xùn)，去掉最高分和最低分，以平均分為綜合評分結(jié)果，評分原則及指標(biāo)如表1所示。

表1 紅棗富硒乳酸菌飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與討論

2.1.1 白砂糖添加量對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

白砂糖作為乳酸菌發(fā)酵所需的碳源，添加量過少，乳酸菌會生長遲緩，產(chǎn)品香味缺乏；添加量過多，使口味過甜[11]。表2得出：4%左右的白砂糖添加量不僅產(chǎn)品的甜度適中，產(chǎn)品口感較好，感官評定分?jǐn)?shù)較高，而且乳酸發(fā)酵速度相對較快，可以節(jié)約發(fā)酵時間。隨著白砂糖添加量的增加，總糖呈現(xiàn)上升的趨勢。白砂糖添加量在0～4%之間時其感官評分呈上升趨勢。添加量4%時，感官評分達(dá)到最高，之后降低。當(dāng)白砂糖添加量為4%時，總酚濃度最高，為9.19±1.08 μg/mL，因此選取白砂糖添加量3%～5%。

表2 白砂糖添加量對乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

2.1.2 紅棗汁添加量對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

由表3可得：經(jīng)過感官品評，以70%紅棗汁和30%脫脂牛奶混合制備的乳酸菌飲料，口感、風(fēng)味最優(yōu)。當(dāng)紅棗汁添加量為70%時，產(chǎn)品紅棗果香與奶香協(xié)調(diào)，口感柔和細(xì)膩，平均感官評分最高，為80分，總酚濃度也最高，為8.94±0.78 μg/mL。隨著紅棗汁添加量的變化，總糖濃度沒有明顯變化。當(dāng)紅棗汁添加量為70%時，總酸濃度為0.52±0.09 g/100 mL，酸度適宜，酸度過高或過低均會影響滋味。因此，該試驗的最佳紅棗汁添加量為70%，選取紅棗汁添加量范圍70%～74%。脫脂牛奶添加過多，風(fēng)味不協(xié)調(diào)，生產(chǎn)成本增加，添加過少，則奶香味過淡。棗汁能夠促進(jìn)乳酸菌生長，使活菌數(shù)增多，紅棗汁與脫脂牛奶混合發(fā)酵制備發(fā)酵乳飲料，使制得的紅棗乳酸菌飲料既具有乳酸香味，又具有棗汁的果香。

表3 紅棗汁添加量對乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

2.1.3 菌液接種量對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

接種量過低時，發(fā)酵時間延長，產(chǎn)酸量較低，容易受到雜菌污染；接種量過高時，發(fā)酵速度雖加快，但細(xì)胞容易衰老，出現(xiàn)自溶現(xiàn)象[12]。由表4可知：隨著接種量的增多，感官評分先升高后緩慢降低，當(dāng)菌液接種量為3%時感官評分達(dá)到最高；接種量越大，總糖濃度越低，說明乳酸菌利用糖為底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，當(dāng)紅棗汁中營養(yǎng)成分較多時，接種量越多，發(fā)酵液中活菌數(shù)越多，最終發(fā)酵液的總酸濃度也就越高；當(dāng)菌液接種量為3%時，總酚濃度最高，為9.49±1.21 μg/mL。發(fā)酵過程中部分結(jié)合酯型酚酸會分解成為游離型酚酸，所以總酚在一定范圍會有所增高，故選取接種量范圍3%～5%。

表4 菌液接種量對乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

2.1.4 發(fā)酵時間對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

發(fā)酵時間的長短會直接影響到發(fā)酵產(chǎn)品口感和風(fēng)味。由表5可知：隨著發(fā)酵時間延長，總糖濃度持續(xù)降低，感官評分先升高后降低緩慢，發(fā)酵24 h時其感官評分達(dá)到最高，總酚濃度為8.21±0.45 μg/mL，說明產(chǎn)品的品質(zhì)最優(yōu)。酸度隨發(fā)酵時間的延長而升高，24 h時總酸濃度為0.52±0.06 g/100 mL，之后增加迅速，酸度過高和酸度不足均會影響乳酸菌飲料的口感和風(fēng)味。因此，發(fā)酵時間選擇24 h。

表5 發(fā)酵時間對乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

2.1.5 發(fā)酵溫度對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

由表6可知：發(fā)酵溫度在36～38 ℃之間時，隨著溫度的升高感官評分逐漸上升，38 ℃時達(dá)到感官評分最高，隨后降低；當(dāng)溫度為38 ℃時，總酸濃度為0.66±0.09 g/100 mL，酸度適宜。發(fā)酵溫度的過高或過低均會影響乳酸菌的生長繁殖，使產(chǎn)酸量降低。隨著發(fā)酵溫度的升高，總酸和總糖的濃度變化不大。發(fā)酵溫度38 ℃最適合乳酸菌的生長繁殖，能快速啟動乳酸發(fā)酵，減短發(fā)酵周期，是紅棗乳酸菌飲料發(fā)酵最適溫度，所以選取的發(fā)酵溫度38 ℃。

表6 發(fā)酵溫度對乳酸菌飲料品質(zhì)的影響

通過分析白砂糖添加量、紅棗汁添加量和菌液接種量對乳酸菌飲料的影響，結(jié)果表明乳酸菌飲料中白砂糖添加量3%～5%、紅棗汁添加量70%～74%、菌液接種量3%～5%時能體現(xiàn)乳酸菌飲料良好品質(zhì)，發(fā)酵最適時間和溫度分別為24 h和38 ℃。

2.2 D-最優(yōu)混料設(shè)計優(yōu)化結(jié)果與分析

2.2.1 感官回歸模型選擇

表7所示為混料設(shè)計方案以及感官評分的預(yù)測值和實際值。對試驗數(shù)據(jù)分別進(jìn)行線性回歸擬合和二次、三次多項式回歸擬合。將感官評分作為響應(yīng)值Y，最終得出回歸模型：

表7 紅棗富硒乳酸菌飲料混料試驗設(shè)計方案

Y=-25.09A+68.42B+52.93C+185.94AB+228.12AC+55.62BC+264.15A2BC+426.69AB2C-730.16ABC2

2.2.2 方差分析

由表8可知：模型的F值為44.44，且p＜0.01，說明該回歸模型是極顯著的，同時失擬項的F值為0.84，相關(guān)p值為0.485 3，表明失擬項不顯著，決定系數(shù)R2為0.980 7，表明感官評分結(jié)果的變異中，由自變量引起的占比98.07%。以上結(jié)果證明該模型能反映出各參數(shù)之間的關(guān)系，可以用來預(yù)測紅棗富硒乳酸菌飲料的感官評分。

表8 回歸模型方差分析表

2.2.3 因子間交互影響分析

圖1為白砂糖添加量、紅棗汁添加量、菌液接種量對感官評分影響的等高線圖和響應(yīng)面圖。等高線圖的形狀可以反映各因子之間交互作用強(qiáng)度，等高線圖呈圓形說明交互作用不顯著，等高線圖呈橢圓說明因子之間交互作用顯著[13]。從圖1可以看出，3個因子的等高線圖呈橢圓型，響應(yīng)面圖均呈向上凸的曲面，說明三者間具有一定的交互作用，感官評分存在最大值。

圖1 三種因子對感官評分影響的等高線圖及3D響應(yīng)面圖

2.3 驗證試驗

采用Design-Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到接近最大感官評分的2種配方，且給出每個配方感官評分的預(yù)測值，結(jié)果如表9所示。當(dāng)白砂糖添加量為4.02%，紅棗汁添加量為72.22%，菌液接種量為3.76%時，預(yù)測的乳酸菌飲料的感官評分最大，為89.32分；當(dāng)白砂糖添加量為4%，紅棗汁添加量為72%，菌液接種量為4%時，預(yù)測的乳酸菌飲料的感官評分為88.65分。按上述優(yōu)化的配方制備乳酸菌飲料，進(jìn)行感官評分并得到實測值。驗證試驗結(jié)果表明，第一組配方的紅棗富硒乳酸菌飲料的感官評分最高，為88分，第二組為87分，與預(yù)測的結(jié)果相一致，說明得到的回歸模型有較高的擬合度。但兩組配方試驗結(jié)果之間無顯著差異，考慮到后來的試驗和生產(chǎn)，在此試驗結(jié)果下選擇更易于試驗和生產(chǎn)的第二組配方。

表9 紅棗富硒乳酸菌飲料配方優(yōu)化結(jié)果

將制備得到的紅棗富硒乳酸菌飲料取10 mL，烘干后用強(qiáng)酸消化，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，用ICP測定樣品的硒濃度，紅棗富硒乳酸菌飲料中硒的濃度為0.50 μg/mL，成人每日飲用100～200 mL該飲品可攝入50～100 μg硒，充分滿足人體每日對硒的生理需要。

3 結(jié)論

通過研究白砂糖添加量、紅棗汁添加量、菌液接種量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對紅棗富硒乳酸菌飲料品質(zhì)的影響，確定了各因素的范圍：白砂糖添加量3%～5%、紅棗汁添加量70%～74%、菌液接種量3%～5%、發(fā)酵溫度38 ℃、發(fā)酵時間24 h。D-最優(yōu)混料設(shè)計優(yōu)化得到的紅棗富硒乳酸菌飲料的配比為白砂糖添加量4%、紅棗汁添加量72%、菌液接種量4%，預(yù)測的乳酸菌飲料的感官評分為88.65分。驗證試驗結(jié)果表明，最優(yōu)配方的紅棗富硒乳酸菌飲料的感官評分為87分，與預(yù)測的結(jié)果相一致，紅棗富硒乳酸菌飲料中硒的濃度為0.50 μg/mL，能夠滿足成年人體對硒的生理需求。