牛乳主要過敏原的拉曼光譜檢測分析

李靖，李夢銀，陳守慧，魏新林*，王元鳳*

1. 上海交通大學農業與生物學院（上海 201100）；2. 上海師范大學生命科學學院（上海 200030）

牛奶是嬰幼兒最先攝入的一種食物，而牛奶過敏在年齡較小的兒童（小于3歲）中出現概率達8%，被確認為幼兒期最常見的食物過敏的原因之一[1]；而美國的一項研究顯示，其約占所有食物所引起過敏反應的20%[2]。在8種主要食物過敏中，牛奶過敏是僅次于花生和堅果的第三大常見過敏。牛奶過敏通常由免疫球蛋白（IgE）介導，牛乳過敏者在食用牛乳及乳制品后會出現各種各樣的功能障礙或組織損傷，嚴重時會造成過敏性休克[3]。目前認為酪蛋白（casein，CN）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛乳主要過敏原[4-6]。用于檢測牛乳過敏原的方法主要包括免疫分析技術[7]、液相色譜技術、生物質譜技術[8]、實時PCR、電噴霧電離質譜等，這些方法雖然靈敏度高，但需要較長的檢測時間或者昂貴的儀器設備。

拉曼光譜是一種研究分子振動的光譜分析技術。拉曼效應是指當一束光照射到介質時，部分光會向四面八方散射，而其中少部分散射光既改變傳播方向，又改變頻率，此種光現象被稱為拉曼效應[9]。無論是氣體、液體或是固體，拉曼效應普遍存在于一切分子中，且每一種物質（分子）都有自己的拉曼光譜特性，因此可將拉曼特征峰用以物質的表征[10]。拉曼光譜由于受水分子干擾小，非常適合生物樣品，被用于快速、無損、方便地檢測多種食品成分。

試驗通過對CN、α-LA、β-LG進行拉曼光譜掃描以獲得其特征峰，并對巴氏殺菌乳、風味發酵乳、干酪等多種乳制品的實際樣品進行拉曼光譜掃描，根據其所含的對應CN、α-LA、β-LG的特征峰可以實現乳制品中過敏原的定性檢測。由此，可以根據實際樣品的拉曼光譜特征峰判斷其過敏原信息，達到定性分析的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-LA（純度95%，美國Sigma公司）；β-LG（純度97%，美國Sigma公司）；CN（純度91%，國藥集團化學試劑有限公司）；巴氏殺菌乳、乳飲品、調味奶漿、煉乳、奶油、干酪和再制干酪（上海沃爾瑪超市）。

1.2 儀器與設備

LD-UPW-10超純水機（上海礫鼎水處理設備有限公司）；Velocity 14R冷凍離心機（上海天美科學儀器有限公司）；VM-01U渦旋混合儀（美國精騏有限公司）；SB-5200DTD超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；色散型共聚焦拉曼光譜儀（德國Bruker Optics公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗樣品的制備

CN、α-LA、β-LG的標準品呈粉末狀直接用于檢測。

巴氏殺菌乳、乳飲品：以12 000 r/min離心15 min去除上清（脂肪），下層樣品斡旋振蕩5 min。

調味奶漿、煉乳、奶油：用水稀釋適量倍數后，以12 000 r/min離心15 min去除上清（脂肪），下層樣品斡旋振蕩5min。

干酪、再制干酪：用60 ℃熱水超聲溶解，用水稀釋適量倍數后，以12 000 r/min離心15 min去除上清（脂肪），下層樣品斡旋振蕩5 min。

1.3.2 拉曼光譜采集條件

將CN、α-LA、β-LG粉末樣品、巴氏殺菌乳等樣品置于載玻片上，其中固體粉末狀樣品需壓平，置于顯微鏡載物臺上，采集拉曼信號。拉曼光譜采集參數設置為：激發波長632.8 nm，激光功率5 mW，曝光時間2 s，每個譜圖的掃描時間8 s，累積次數3次，掃描范圍45～4 500 cm-1。

1.3.3 圖譜預處理與數據分析

拉曼光譜的掃描需要經過基線校正和平滑降噪2個預處理步驟。用Origin Pro 8.5軟件進行曲線繪制和平滑處理。

2 結果與討論

2.1 標準品光譜數據處理

對3種蛋白標品進行拉曼檢測，并進行去噪和平滑處理，見圖1。

圖1 CN（a）、α-LA（b）、β-LG（c）的拉曼光譜圖

2.2 標準品光譜分析

拉曼光譜中的酰胺Ⅲ區（1 230～1 340 cm-1）是蛋白質構象靈敏度的譜帶區，該區域能夠提供相關主鏈構象的振動信息[11]，包括C—N振動、N—H面內彎曲振動等，也能夠反映蛋白質二級結構的信息，如α-螺旋結構、芳香環的振動等；酰胺Ⅰ區（1 600～1 700 cm-1）對解析蛋白質的二級結構提供更加豐富的信息，不僅含有C＝O伸縮振動的信息，還包含多肽鏈內部的C—N振動等的信息[12]。

CN、α-LA、β-LG光譜圖經過預處理后，在757～3 060 cm-1處信號豐富。CN在994，1 337，1 451，1 679，2 934和3 060 cm-1處信號豐富，存在1 679 cm-1的酰胺Ⅰ（β-折疊結構）和位于1 230～1 340 cm-1的酰胺Ⅲ蛋白質骨架信號，基本表現在1 337 cm-1處；α-LA的拉曼光譜特征峰為757，883，1 002，1 129，1 333，1 446，1 558，1 663，2 931和3 061 cm-1，存在1 663 cm-1的酰胺Ⅰ區（α-螺旋結構含量高）和位于1 230～1 340 cm-1的酰胺Ⅲ區蛋白質骨架信號，基本表現在1 333 cm-1處，酰胺Ⅱ振動發生在1 510～1 570 cm-1區域，表現在1 558 cm-1處，屬于面內氮氫變形與碳氮拉伸的異相組合，信號弱；β-LG在1 007，1 240，1 301，1 444，1 552，1 667，2 931和3 060 cm-1處拉曼峰強度大，存在1 667 cm-1的酰胺Ⅰ（β-折疊結構含量高）和位于1 230～1 340 cm-1的酰胺Ⅲ蛋白質骨架信號，基本表現在1 240 cm-1和1 301 cm-1處，酰胺Ⅱ區振動表現在1 552 cm-1處。

根據常見化學基團的拉曼峰歸屬及其他相關報道的對照分析，可對CN、α-LA、β-LG的光譜特征峰進行峰位歸屬[13-16]。

2.3 實際樣品中牛乳過敏原的定性檢測

選取液體乳、煉乳、乳脂肪、干酪等4類乳制品進行拉曼檢測，對照表1中所示的過敏原特征峰判斷實際樣品中是否含有牛乳主要過敏原CN、α-LA、β-LG。

表1 乳及乳制品主要過敏原拉曼特征峰歸屬

選擇液體乳中的巴氏殺菌乳、乳飲品、調味奶漿等進行拉曼光譜掃描（見圖2）。巴氏殺菌乳的拉曼光譜中譜峰為1 046，1 180，1 311，1 415和1 571 cm-1，經對照驗證后發現巴氏殺菌乳內含β-LG；乳飲品的拉曼譜峰為1 047，1 182，1 310，1 416和1 571 cm-1，經匹配后發現乳飲品內含β-LG；調味奶漿的拉曼特征峰為1 046，1 178，1 309，1 415和1 571 cm-1，經對照分析后發現調味奶漿內含β-LG。

圖2 巴氏殺菌乳（a）、乳飲品（b）、調味奶漿（c）拉曼光譜圖

煉乳的光譜峰為894，1 527，1 655，1 761，2 885和3 892 cm-1，經分析后發現煉乳內含α-LA。煉乳拉曼光譜圖見圖3。

圖3 煉乳拉曼光譜圖

乳脂肪是以乳脂肪為原料濃縮而成的乳制品，主要包括稀奶油、黃油等。奶油的拉曼光譜圖見圖4。特征峰為572，1 083，1 302，1 435，2 851，3 649和3 969 cm-1，經對照分析后發現其中含β-LG。

圖4 奶油拉曼光譜圖

干酪是指在生鮮牛奶加工過程中加入凝乳酶，使奶中的蛋白質凝固，經過發酵、壓榨等過程所制得的奶制品。奶酪和再制干酪拉曼光譜情況見圖5。奶酪的拉曼光譜特征峰為1 441，2 852，3 656，3 837和3 971 cm-1，經匹配后發現奶酪內含β-LG；再制干酪在1 652，2 934和3 969 cm-1處表現出較強的拉曼信號，經對照、匹配后發現再制干酪內含α-LA。

圖5 奶酪（a）和再制干酪（b）拉曼光譜圖

3 討論

由測得的拉曼光譜來看，不同物質有著不同的拉曼光譜，這是因為它們具有不同的化學組成，而各組成元素之間又有著不同的振動模式，如對稱伸縮振動、非對稱伸縮振動、彎曲振動等，這些都造成拉曼信號相對于激發源頻率的移動，于是產生拉曼光譜圖中豐富的特征振動峰。

試驗通過色散型共聚焦拉曼光譜儀對牛乳主要過敏CN、α-LA和β-LG進行拉曼光譜檢測，分析3種蛋白的特征峰及其分子結構歸屬，在757～3 060 cm-1處拉曼信號豐富。酪蛋白的拉曼特征峰為994，1 337，1 451，1 679，2 934和3 060 cm-1，α-LA的拉曼特征峰為757，883，1 002，1 129，1 333，1 446，1 558，1 663，2 931和3 061 cm-1，β-LG的拉曼特征峰為1 007，1 240，1 301，1 444，1 552，1 667，2 931和3 060 cm-1。經拉曼掃描及對照分析，巴氏殺菌乳、乳飲品、調味奶漿、奶油、奶酪內含β-LG，煉乳、再制干酪內含α-LA。

拉曼光譜在過敏原檢測方面可從2個方面發展：一是匯總更多的過敏原基本圖譜信息，建立小型的過敏原拉曼光譜數據庫，并有望建立數字化的光譜數據庫系統，為實際樣品提供過敏原數據支撐，實現過敏原的定性檢測；二是由于拉曼技術直接用于檢測蛋白信號會較弱，因此可以利用表面增強拉曼光譜技術提高檢測靈敏度，以實現高靈敏的定量檢測。