不同澄清劑對枳椇果酒澄清效果

黃蕭天，巴特，魏丕偉*，王凌云，何發明，王江林

四川輕化工大學（宜賓 644000）

枳椇（Hovenia dulcis）為鼠李科拐棗屬落葉喬木[1]，始載于《唐本草》，別名拐棗、龍爪、雞爪果、萬壽果等，被國家衛計委列入食藥兩用中藥名單。主要分布在四川、廣西、湖北、廣東、貴州等省份[2]。枳椇成熟的肉質果梗中含有豐富的營養成分和生理活性物質，主要包括生物堿、活性黃酮類物質、三萜皂苷類、苯丙素類、多糖等[3-5]；因此枳椇也含有很多功效，如減肥降脂[6]、保肝解酒[7]、抗腫瘤[8]、增加免疫力與抗疲勞[9]等，是一種極具開發利用的植物資源，經過發酵制成的枳椇果酒也繼承了枳椇其豐富的營養和獨特的風味，具有良好的藥用價值與市場價值。

由于枳椇本身含有較多的蛋白質、果膠、色素等[10]物質以及受生產工藝條件的影響，枳椇果酒在儲存過程中會出現渾濁、失光等現象，嚴重影響枳椇果酒的品質。因此為提高枳椇酒的品質、延長其貨架期、增強其穩定性，需對枳椇果酒進行澄清工藝優化及穩定性檢測。試驗選取明膠、皂土、殼聚糖、硅藻土、果膠酶5種澄清劑，進行單因素澄清試驗，并選擇3款最佳的澄清劑進行正交試驗，得出最佳復合澄清劑配比，結合穩定性試驗，確定合理有效的澄清方法，以期為枳椇酒的生產加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

枳椇干果（產地湖北黃岡）；釀酒酵母（安琪葡萄酒酵母）；明膠（成都金山化學試劑有限公司）；皂土（上海試四赫維化工有限公司）；果膠酶（法國LAIFEMAND公司）；殼聚糖（鄭州萬博食品配料有限公司）；殼聚糖（鄭州萬博食品配料有限公司）；硅藻土（成都科龍化工試劑廠）；蘆丁（合肥博美生化科技有限責任公司）；其余試劑均為國產分析純。

1.2 試驗儀器

UV-5500PC紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HS-2數顯恒溫水浴鍋（太倉市華利達實驗設備有限公司）；TGL-16G臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；FA2204N電子天平（常州市衡正電子儀器有限公司）；GZ-250-HSII恒溫培養箱（韶關市廣智科技設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 枳椇果酒的發酵工藝流程

枳椇→烘干→研磨→加水混勻→偏重硫酸鉀處理→超聲波微處理→酶解→45 ℃水浴恒溫2 h→調pH 5.0→調糖度20%→發酵→澄清→過濾→成品→檢測

1.3.2 理化指標的測定

1.3.2.1 酒精度

按照GB 5009.225—2006[11]規定的方法測定。

1.3.2.2 黃酮質量濃度

1) 蘆丁標準曲線的測定

蘆丁標準溶液的配制：精密稱取蘆丁對照品19.5 mg，加入蒸餾水定容至100 mL。取蘆丁標準品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL分別放置在25 mL試管中，加入30%乙醇溶液至6.0 mL，分別加入5%NaNO2的溶液和10%的Al(NO3)3溶液各1 mL，分別加入4% NaOH溶液10 mL。搖勻，靜置6 min，用空白溶液（蒸餾水）做參照。用紫外可見分光光度計在波長510 nm處測定其吸光度A，以吸光度為縱坐標、蘆丁濃度為橫坐標繪制標準曲線。

2) 枳椇果酒黃酮質量濃度的測定

以1 mL枳椇果酒代替蘆丁標準品溶液，并按照上述標準曲線回歸方程計算黃酮質量濃度。

1.3.3 澄清度波長的選定

采用全波段掃描的方式，在400～800 nm下進行掃描，選擇最低吸光度下對應的波長。

1.3.4 澄清劑的配制1%明膠溶液[12]、1%硅藻土溶液[13]、10%皂土溶液[14]、1%殼聚糖溶液[15]、1%果膠酶溶液[16]。

1.3.5 單因素試驗

取10 mL發酵7 d的枳椇果酒于試管中，分別按表1試驗方案加入澄清劑，迅速震蕩搖勻，室溫靜置48 d，取上清液，在最佳波長下，測其透光率，并且按照1.3.2的方法，測定枳椇果酒中黃酮質量濃度。

表1 5種澄清劑單因素試驗水平

1.3.6 正交試驗

根據單因素試驗結果，選取3種澄清效果最佳的澄清劑，在單因素的試驗基礎上采用三因素三水平的正交試驗，確定復合澄清劑的最佳配比，并取最適配比做3個重復試驗，驗證其可行性。

1.3.7 穩定性試驗

根據澄清試驗結果，選取最佳澄清工藝處理果酒，并取上清液做穩定性試驗，包括蛋白質穩定性、鐵穩定性、銅穩定性、氧化穩定性、生物穩定性[17-20]。

2 結果與分析

2.1 枳椇果酒的理化指標

2.1.1 枳椇果酒黃酮質量濃度

由1.3.2得到線性回歸方程為y=9.808 2x-0.004 2，R=0.999 5。結果表明，蘆丁標準品質量濃度在0.00～6.08 mg/mL范圍內與吸光度呈現良好的線性關系，并測得枳椇果酒在510 nm下的吸光度為0.14，根據該方程，可以算出枳椇果酒中黃酮質量濃度為14.70 mg/L。

2.2 澄清度波長的測定

對枳椇果酒進行400～800 nm的波段掃描，隨著波長增加，吸光度逐漸減小直至平衡，波長為680 nm時，吸光度達到最低，此時的透光率最大，因此，選用680 nm作為枳椇果酒最佳澄清波長。與之相對應的吸光度為0.103，此時的透光率為78.8%。

2.3 枳椇果酒澄清工藝的單因素試驗結果

2.3.1 明膠添加量對枳椇果酒澄清效果的影響

明膠作為果酒常用澄清劑，可結合中單寧并吸附其他雜質形成沉淀[21]。由圖2所示，在明膠添加量范圍內，透光率呈先上升后下降趨勢，添加量5.0 g/L時，透光率達到最大值64.60%。隨添加量增大，透光率明顯下降，可能是由于酒中單寧含量過少，過量的明膠本身就會形成懸浮物，導致澄清度下降[22]。但最佳透光率64.60%顯著低于枳椇果酒原來的透光率78.8%，因此不采用明膠澄清枳椇果酒。

圖2 明膠添加量對枳椇果酒澄清效果的影響

2.3.2 硅藻土添加量對枳椇果酒澄清效果的影響

硅藻土是一種生物成因的硅質沉積巖，由于其結構的特殊性，賦予它強力的吸附性；同時，它還可以吸附部分的果膠、色素、酵母等其他固體懸浮物，從而達到澄清原酒的目的[23]。由圖3可知，在硅藻土添加量范圍內，透光呈先上升后下降再趨于穩定趨勢，另外，黃酮質量濃度呈先上升后趨于穩定的趨勢，硅藻土添加量0.2 g/L時，透光率達到最大值88.03%，黃酮質量濃度達到最大值為8.51 mg/L。因此，取硅藻土添加量0.2 g/L時，進行靜置試驗。

圖3 硅藻土添加量對枳椇果酒澄清效果的影響

新發酵的酒，由于酒石酸鹽沉淀、色素沉淀、金屬破敗、微生物混濁等[24]因素。澄清度變化較大，因此需要對澄清后的枳椇酒進一步檢測其不同儲存時間的透光度及黃酮質量濃度變化。由圖4可知，將硅藻土添加量0.2 g/L的枳椇酒進行不同時間的靜置處理，在靜置時間1～5 d范圍內，透光率緩慢下降，說明硅藻土能在較短的時間內達到最佳澄清效果，但可能還有生物與非生物因素的影響，影響枳椇酒的長期儲存。另外，黃酮質量濃度呈先上升后減少再趨于穩定趨勢，靜置2 d時，枳椇果酒中黃酮質量濃度最高為9.63 mg/L。因此，最佳硅藻土添加量0.2 g/L、靜置時間2 d，此時透光率為86.73%，黃酮質量濃度為9.63 mg/L。

圖4 靜置時間對枳椇果酒澄清的影響

2.3.3 皂土添加量對枳椇果酒澄清效果的影響

皂土吸水膨脹后形成膠體懸浮液，顆粒帶負電，吸附酒液中帶正電荷的蛋白質，形成絮狀沉淀，從而使酒液澄清[23]。由圖5可知，在皂土添加量范圍內，透光率呈先上升后下降再趨于穩定趨勢，皂土添加量4.0 g/L時，澄清效果達到最佳，透光率達到87.10%，添加量超過4.0 g/L時，透光率逐漸降低，可能是因為過量的皂土會導致下膠過量，引起酒體渾濁，同時影響酒體口感。另外，黃酮質量濃度呈先上升再趨于穩定趨勢，添加量4.0 g/L時，黃酮質量濃度達到最大，為7.80 mg/L。因此，取皂土添加量4 g/L時，進行靜置試驗。

圖5 皂土添加量對枳椇果酒澄清效果的影響

由圖6可以知道，在靜置時間1～5 d范圍內，由透光率呈上升后下降趨勢，靜置2 d時，透光率達到最大值，為89.30%，之后緩慢下降，另外，黃酮質量濃度呈下降再緩慢回升趨勢，兩者可能是酒體依然存在穩定性不好的原因。因此，最佳皂土用量4 g/L、靜置時間2 d，此時透光率達到89.30%，黃酮質量濃度為8.68 g/mL。

圖6 靜置時間對枳椇果酒澄清的影響

2.3.4 果膠酶添加量對枳椇果酒澄清效果的影響

果膠酶又稱聚半乳糖醛酸水解酶，是分解果膠的一種復合物質，能夠提高果蔬的出汁率、降低粘度，具有提高果汁、果酒澄清度的作用[25]，由圖7可所示，在果膠酶添加量范圍內，透光率呈先上升后緩慢下降的趨勢，果膠酶添加量達到0.04 g/L時，透光率達到最大值85.20%，添加量超過0.04 g/L時，透光率呈緩慢下降趨勢。可能是果膠酶添加量過多，酶蛋白又會使果汁產生混濁現象，造成透光率下降[25]。另外，黃酮質量濃度呈先上升后下降再趨于穩定趨勢，果膠酶質量濃度0.04 g/L時，黃酮質量濃度達到最大8.92 mg/L，其后，黃酮質量濃度降低，可能是果膠酶過量添加，吸附了干浸出物，使黃酮質量濃度降低。因此，取果膠酶添加量0.04 g/L時，進行靜置試驗。

圖7 果膠酶添加量的對枳椇果酒澄清效果的影響

由圖8可知：在靜置時間1～5 d范圍內，透光率呈上升后下降趨勢，靜置2 d時，透光率達到最大值，為85.20%，與靜置1 d時的透光率84.03%相差不大，可能需要充分的時間才能分解掉酒體中的果膠；2 d后的透光率的緩慢下降，可能是因為酒體沒有足夠的穩定性。另外，黃酮質量濃度呈下降再趨于穩定趨勢，靜置3 d時，達到最低值8.62 mg/L，之后酒體趨于穩定。因此，最佳果膠酶用量0.04 g/L、澄清時間1 d，此時透光率達到84.03%。黃酮質量濃度為10.92 mg/L。

圖8 靜置時間對枳椇果酒澄清的影響

2.3.5 殼聚糖添加量對枳椇果酒澄清效果的影響

殼聚糖是一種高分子聚合物，在微酸環境下，易被電子化，與氫離子、氨基結合形成帶有正電荷的分子，賦予其較強的吸附性，是一種典型的陽離子型絮凝劑[26]。由圖9可知，殼聚糖添加量范圍內，透光率呈先上升后下降趨勢。殼聚糖質量濃度0.4 g/L時，透光率達到最大值為90.23%，隨著添加量繼續增加，透光率減少，其原因可能是過量的殼聚糖會包裹微粒，影響架橋作用。與此同時，膠體表面還會產生二次吸附作用，影響澄清作用的持久性，吸附過多的有效成分，影響口感[26]。另外，黃酮質量濃度呈先上升后下降再趨于穩定趨勢，殼聚糖添加量0.4 g/L時，黃酮質量濃度達到最大，為10.31 mg/L，因此，取殼聚糖質量濃度0.4 g/L時，進行靜置試驗。

圖9 殼聚糖添加量對枳椇果酒澄清效果的影響

由圖10可知：在靜置時間1～5 d范圍內時，透光率呈上升后下降趨勢，靜置2 d時，透光率達到最大值為91.00%，其后，透光率的下降可能是因為膠體表面還會產生二次吸附作用，進而影響微粒的穩定，影響澄清作用的持久性[26]；在靜置時間1～5 d范圍內，黃酮質量濃度先上升再下降后趨于穩定，在靜置時間2 d時，達到最大值為10.02 mg/L，2 d后的下降可能是殼聚糖膠體充分地接觸，在靜置時間3 d時，達到最小值為8.24 mg/L。因此，最佳殼聚糖添加量0.4 g/L、澄清時間2 d，此時的透光率為91.00%，黃酮質量濃度為10.02 mg/L。

圖1 蘆丁標準曲線回歸方程

圖10 靜置時間對枳椇果酒澄清的影響

2.4 正交試驗優化復合澄清劑澄清枳椇果酒工藝條件

根據單因素試驗結果綜合分析，硅藻土、皂土、果膠酶和殼聚糖對枳椇酒的澄清有明顯效果，其中殼聚糖透光率為91.0%，黃酮質量濃度為10.02 mg/L，澄清效果最佳；其次皂土透光率為89.30%，黃酮質量濃度為8.68 mg/L，透光率與澄清效果良好；硅藻土透光率為86.37%，黃酮質量濃度為9.63 mg/mL，澄清效果次之，但黃酮質量濃度較高；果膠酶透光率為84.03%，黃酮質量濃度為10.92 mg/mL，雖然黃酮質量濃度較高，但透光率較低，澄清效果相比一般；故選擇硅藻土、皂土和殼聚糖三者為最終的復合澄清劑。同時結合靜置試驗，確定靜置時間為2 d。

以透光率和黃酮質量濃度為指標，比較皂土、硅藻土和殼聚糖在最佳添加量下對枳椇果酒的澄清效果。由正交試驗結果可以得出影響透光率的主次因素A＞C＞B，即皂土＞殼聚糖＞硅藻土，優水平為A3B1C1；同理，影響黃酮質量濃度的主次因素C＞B＞A，即殼聚糖＞硅藻土＞皂土，優水平為A2B1C2；由表3可知不同組合下，黃酮質量濃度的變化并不顯著，因此，以透光率為主要指標，及A3B1C1組合為最佳試驗組合，即皂土添加量6.0 g/L、殼聚糖添加量0.1 g/L、硅藻土添加量0.2 g/L。

表3 復合澄清劑澄清工藝優化正交試驗結果與分析

2.5 驗證性試驗

對最佳處理條件A3B1C1進行重復性試驗，以確定枳椇果酒澄清工藝的最佳方案。在復合澄清劑的處理下，取3次生物學重復，枳椇果酒透光率為92.60%，高于正交試驗結果中最高透光率92.30%，其黃酮質量濃度為11.30 mg/L。

表2 澄清工藝優化正交試驗因素與水平 單位：g/L

2.6 枳椇果酒的穩定性

果酒穩定性主要受生物穩定性與非生物穩定性的影響，生物穩定性主要包括蛋白質與微生物等有機成分的影響，非生物穩定性主要包括氧破敗、鐵破敗、銅破敗等影響[27]。取澄清工藝優化后的枳椇果酒的上清液做穩定性試驗。

2.6.1 蛋白質穩定性

通過單寧-加熱法試驗觀察，對比酒體前后的差異，有沒有絮凝性沉淀。結果表明，澄清處理后的枳椇果酒沒有產生沉淀，少量的蛋白質不足以發生蛋白質破敗，其蛋白質的穩定性良好。

2.6.2 鐵穩定性

果酒中的鐵一般以還原態的形式存在，但Fe3+極易與果酒中的某些成分如色素，單寧，磷酸鹽等結合產生不溶性沉淀[28]。結果表明，枳椇果酒沒有出現渾濁現象，且測得鐵含量為4 mg/L，果酒中鐵含量低于8 mg/L時，果酒就不會發生鐵破敗病[29]，證明其鐵穩定性良好。

2.6.3 銅穩定性

果酒中的銅易被還原成亞銅，形成難溶性化合物，在光照下亞硫酸將胱氨酸還原為半胱氨酸，然后半胱氨酸與銅生成不溶解的絡合物。試驗測得銅含量0.3 mg/L，小于0.8 mg/L，沒有發生銅破敗[29]，證明其銅穩定性良好。

2.6.4 氧化穩定性

放置24 h后的枳椇果酒與原枳椇果酒相比，色澤沒有明顯變化，亦沒有出現沉淀以及渾濁的現象。同時測得枳椇果酒中游離的二氧化硫的含量為34.53 mg/L。質量濃度在30～50 mg/L[27]中，不會導致明顯的銅破敗和鐵破敗，所以枳椇果酒的氧化穩定性好。

2.6.5 生物穩定性

由于微生物對酒組成成分的代謝作用，會破壞酒的膠體平衡，導致酒體渾濁或沉淀生成[29]。在30 ℃恒溫箱中放置10 d的酒樣和原酒相比，沒有發生渾濁現象，沒有受到其他病菌的污染，說明枳椇果酒的生物穩定性較好。

3 結論

通過使用明膠、硅藻土、殼聚糖、果膠酶、皂土5種澄清劑對枳椇果酒進行澄清試驗，以透光率和黃酮質量濃度為指標，同時對澄清后的枳椇果酒進行靜置試驗，篩選出3種對枳椇果酒澄清效果較好的澄清劑：皂土、硅藻土和殼聚糖。正交試驗優化其配比后，復合澄清劑最佳配比為：皂土6 g/L，硅藻土0.1 g/L、殼聚糖0.4 g/L。通過驗證性試驗，證明在最佳復合澄清劑配比下，靜置時間為2 d，其透光率達到92.6%，黃酮質量濃度為1.13 mg/L，整體優于單一澄清劑的澄清效果。

通過對處理后的枳椇果酒進行穩定性試驗，澄清后的枳椇酒擁有有良好的穩定性。其中蛋白質穩定性與生物穩定性良好，沒有絮凝性沉淀；同時，酒體中鐵離子質量濃度為4.0 mg/L，銅離子質量濃度為0.3 mg/L，SO2質量濃度為34.53 mg/L，均在合理范圍內，不會發生明顯的銅破敗與鐵破敗，氧化穩定性良好。此復合澄清劑整體澄清效果良好，澄清后的枳椇果酒穩定性高。由于澄清劑不同的澄清性質及酒類的不同，復合澄清劑的澄清效果總體要優于單一澄清劑，該試驗為枳椇果酒的生產與加工奠定理論基礎 。