動態高壓微射流對大豆分離蛋白性質和結構的影響

敬思群*，王德萍，周苗苗，縱偉

1. 韶關學院英東食品學院（韶關 512005）；2. 新疆大學生命科學與技術學院（烏魯木齊 830046）；3. 鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，食品生產與安全河南省協同創新中心（鄭州 450002）

動態高壓微射流技術（DHPM）是一種新型的超高壓均質方式，集輸送、加壓、混合、超微粉碎等的功能原理于一體。處理裝置主要包括超微粉碎室、微射流室和超高壓泵，料液進入超微粉碎室時，由于高壓作用物料受到超微粉碎破壞大分子顆粒形成納米微粒。其機理主要是結合空穴作用、剪切力和高速率，對樣品產生巨大的壓力，使物料起著較好的超細化處理效果[1-2]。動態高壓微射流技術在食品、藥品、生化等方面都有應用，如乳化均質、濕法超微化、大分子改性、滅菌、脂質體的制備等處理[3]。大豆分離蛋白（SPI）是食品加工中的重要原料，具有較高的營養價值和功能特性，大多研究集中于動態高壓對大豆分離蛋白功能特性的影響，如起泡性、膠凝性、乳化性等[4-5]，鮮見動態超高壓對大豆分離蛋白水溶液的微觀結構、理化性質和二級結構作用的報道[6]。

試驗以20，40，80，120和160 MPa處理大豆分離蛋白溶液，分析動態高壓微射流對大豆分離蛋白的粒徑分布、Zeta電位、蛋白溶解度、蛋白質的二級結構和形貌變化的影響，為進一步研究動態高壓對蛋白與多糖共存體系的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆分離蛋白（純度達到90%，食品級，哈高科大豆食品有限公司）；疊氮化鈉；氫氧化鈉、考馬斯亮藍、鹽酸（均為分析級）。

FPG128000動態高壓微射流（英國SFP公司）；Nano-ZS90激光散射儀（英國Malern公司）；XYFD-18冷凍干燥機（上海欣諭儀器有限公司）；JSM-6490LV掃描電鏡（日本JEOL公司）；Vertex70傅里葉紅外光譜儀（美國Bruker公司）；T6紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白水溶液的制備

將大豆分離蛋白加入到去離子水中，在磁力攪拌下配制成濃度2 mg/mL的母液，攪拌20 min后，經膠體磨將其細化及均勻分布，用1 mol/L NaOH調節溶液pH 7.0，在4 ℃下水化過夜，經20 MPa普通均質機均質后，得到大豆分離蛋白水溶液

1.2.2 動態超高壓微射流處理

參照敬思群等[7]的方法稍作改動進行對大豆分離蛋白進行處理。采用高壓微射流機均質機在均質壓力分別為40，80，120和160 MPa對大豆分離溶液進行2次循環處理，以未經任何處理的大豆分離蛋白水溶液作為對照，以20 MPa下的大豆分離蛋白作為陽性對照，加入濃度0.02%的NaN3作為抑菌劑。除直接取樣測定粒度分布外，剩余樣品冷凍干燥后待測。

1.2.3 粒徑和電位

參照Sun等[8]的方法稍作改動測定大豆分離蛋白溶液的粒徑和電位。采用Nano-ZS90型激光散射儀同時對不同條件下處理的樣品進行粒徑和電位分析。

1.2.4 蛋白溶解性測定

參照張晶等[9]的方法稍作改動測定大豆分離蛋白溶解度。樣品溶液在10 000 r/min下離心20 min后，取上清液稀釋到合適的濃度，取1 mL于試管中，加入5 mL考馬斯亮藍試劑，振蕩搖勻后，在595 nm處比色測定吸光度。原樣品的總蛋白質含量則使用凱氏定氮法測定。上清液中蛋白質含量與原蛋白含量的比值即為溶解度指數S（%），S（%）表示的是蛋白溶解度。

1.2.5 傅里葉紅外分析

根據陳登龍等[10]的方法稍作改動分析大豆分離蛋白功能基團的特征。冷凍干燥的樣品與KBr混合，研磨壓片，置于傅里葉紅外光譜儀中掃描，每個樣品掃描34次，檢測器為HgCdTe，分辨率為4 cm-1，波數范圍4 000～400 cm-1。

1.2.6 SEC掃描電鏡分析

將樣品冷凍干燥后粘于樣品臺上并進行噴鍍電導層，在高分辨率掃描電子顯微鏡下觀察大豆分離蛋白的形貌變化。

1.2.7 數據處理

采用Origin 8.5進行數據處理，用SPSS 17.0進行方差分析，p＜0.05時表示差異性顯著。所有試驗平行3次，結果表示為均數±標準差。

2 結果與討論

2.1 動態高壓對大豆分離蛋白顆粒尺寸的影響

由圖1可知：在常壓下，大豆分離蛋白溶液中顆粒尺寸分布不均勻，出現3個峰，其中91.2%的顆粒的粒徑達到429.133 nm，5.3%的顆粒的粒徑尺寸達到86.27 nm，而3.5%顆粒的尺寸達到5 279.5 nm，總體上0.1 MPa下的大豆分離蛋白的平均粒徑尺寸為259.80±19.126 nm。而20，40，80，120和160 MPa的條件下，顆粒的平均粒徑分別為202.60±8.591 nm、174.73±3.403 nm、159.13±4.398 nm、153.90±5.237 nm和147.6±2.851 nm。總之粒徑體積分數分布隨著壓力增加向小粒徑尺寸移動。這與Sun等[11]研究動態高壓微射流對玉米蛋白的粒徑分析相似。

圖1 動態高壓微射流對大豆分離蛋白溶液粒徑體積分數的影響

表1 不同壓力下大豆分離蛋白粒徑尺寸方差分析

表2 不同壓力下大豆分離蛋白粒徑尺寸多重比較

根據方差分析和多重比較可知，動態高壓微射流對大豆分離蛋白的粒徑分布有顯著影響，120和160 MPa下的大豆分離蛋白與80和40 MPa下的大豆分離蛋白的平均粒徑相比，有顯著性差異（p＜0.05）；80和40 MPa下的大豆分離蛋白的平均粒徑與20 MPa下的大豆分離蛋白相比，有顯著差異性（p＜0.05）；與0.1 MPa下相比，20 MPa下大豆分離蛋白的平均粒徑有顯著性差異（p＜0.05）。

2.2 動態高壓對大豆分離蛋白Zeta電位的影響

在大豆分離蛋白溶液中，其顆粒穩定的存在在水溶液中不僅與顆粒大小有關，還與其表面帶點情況有密切的關聯。未經動態高壓微射流處理大豆分離蛋白水溶液（即0.1 MPa下的大豆分離蛋白）Zeta電位達到-26.30±0.624，20，40，80，120和160 MPa下大豆分離蛋白水溶液的Zeta電位分別為-22.13±0.569，-22.767±1.600，-22.867±1.422，-22.867±1.050和-21.80±0.692，由圖2可知，動態高壓微射流對大豆分離蛋白水溶液的Zeta電位的影響與常壓下的大豆分離蛋白溶液具有顯著性差異（p＜0.05）。由于Zeta電位均為負值，說明大豆分離蛋白表面帶負電荷，即相同電荷的粒子間相互排斥，所以大豆分離蛋白間不易形成聚合體，從而增加蛋白溶液的穩定性。對照組與不同壓力下的蛋白溶液相比，在壓力作用下，其Zeta電位有所上升，其主要可能是由于動態高壓微射流處理大豆分離蛋白破壞蛋白表面結構，導致內部部分帶正電荷的物質暴露，導致Zeta電位上升[12]。

圖2 動態高壓微射流對大豆分離蛋白水溶液Zeta電位的影響

2.3 動態高壓微射流對大豆分離蛋白溶解性的影響

以牛血清蛋白為標準蛋白，制作標準曲線，從而進一步測定溶液的蛋白含量，標準曲線標準方程為y=0.158 6x-0.143 9，R2=0.998 3。如圖3所示，隨著壓力升高，大豆分離蛋白溶解性也發生一定變化，壓力從0.1 MPa升到40 MPa時，其溶解性呈直線上升，而壓力超過40 MPa后其溶解性無顯著性變化，即動態高壓微射流在一定程度上可以提高蛋白質的溶解性。

圖3 動態高壓微射流對大豆分離蛋白溶解性的影響

2.4 動態高壓微射流對大豆分離蛋白二級結構的影響

傅里葉紅外光譜對不同壓力下的大豆分離蛋白進行鑒定，由于蛋白質的官能團在紅外圖譜上表現相應的特征吸收峰，從而來判斷動態高壓微射流對大豆分離蛋白結構的影響[13]。蛋白質最常見的二級結構分析是酰胺帶，酰胺Ⅰ（1 600～1 700 cm-1）其振動頻率取決于C＝O和N—H之間的氫鍵性質，酰胺Ⅱ帶（1 600～1 500 cm-1）振動頻率取決于C—N伸縮振動和N—H面內角變振動，酰胺Ⅲ帶（1 300～1 200 cm-1）其振動頻率取決于C＝O的伸縮振動和N—H面內變角振動，特征振動頻率反映了蛋白質的二級結構中的α-螺旋、β-折疊、β-拐角和無規則卷曲[14-16]。如圖4所示，大豆分離蛋白在3 267 cm-1處主要是—NH的伸縮振動，其吸收峰主要是（RCORNH）的吸收峰。波數在1 631 cm-1和1 525 cm-1也出現強吸收峰，波數在1 631 cm-1的吸收峰主要是由—C＝O的伸縮振動引起，波數1 525 cm-1時是由于N—H面內彎曲振動造成，其譜帶為酰胺Ⅱ帶，而—CH—亞甲基的對稱伸縮振動帶和反對稱伸縮振動的波數在3 066 cm-1和2 923 cm-1處，—CH彎曲振動的波數在1 446 cm-1和1 397 cm-1處，波數在1 234 cm-1和1 072 cm-1出現的峰分別是由于—CH和—CN的伸縮振動形成的峰。經過動態高壓微射流處理后大豆分離蛋白的紅外光譜圖發生輕微差異。由—NH伸縮振動造成的峰的波數由3 267 cm-1處分別移至3 382，3 276，3 273，3 271和3 276 cm-1，其均有紅移趨勢，亞甲基對稱伸縮振動和反對稱伸縮振動在不同壓力下也產生不同趨勢的紅移現象。其中在80 MPa下的大豆分離蛋白在波數1 462 cm-1的位置上峰變化較大，紅移16 cm-1，在此峰位置的其他壓力下的大豆分離蛋白也發生一定紅移趨勢，表明動態高壓微射流對大豆分離蛋白二級結構中的—CH基團影響較大從而產生彎曲振動。由紅外光譜圖可知動態高壓微射流處理大豆分離蛋白后并沒有產生新的化學結構和功能性基團，但吸收峰的波數因壓力的變化而變化，均發生不同程度的紅移或藍移現象，并其峰面積也發生一定變化，故大豆分離蛋白分子中的特殊官能團的含量也發生一定變化，造成蛋白質的二級結構的變化，即α-螺旋、β-折疊、β-拐角和無規則卷曲的含量也隨之變化，在高壓作用下發生相互轉化。

圖4 不同壓力下大豆分離蛋白的傅里葉紅外光譜圖

2.5 動態高壓微射流對大豆分離蛋白表面特征的影響

由圖5可知，0.1 MPa下（未經動態高壓處理的常壓下）處理的大豆分離蛋白表面光滑，大小不一，并有團聚現象，結構緊密。蛋白質與蛋白質之間易形成聚合體，分布比較集中。20 MPa下的大豆分離蛋白結構明顯被破碎，經壓力作用下蛋白表面不光滑，有少量被破碎的蛋白出現，結構稍微開始松散，但仍有聚合現象產生。經過動態高壓微射流后壓力達到40 MPa時，蛋白質與蛋白質之間形成絲狀網絡結構，并未使蛋白質破碎成小顆粒，絲狀蛋白表面光滑細膩，可能是由于大豆分離蛋白經動態超高壓微射流兩次微射流化，第1次時大豆分離蛋白劇烈破碎，蛋白質分子官能團暴露，經第2次的微射流時由于壓力的作用使得蛋白質與蛋白質相互作用從而聚合形成絲狀網絡結構[17-18]。壓力達到80 MPa時，由于過高壓力，使得蛋白質與蛋白質不易進行聚合，故形不成聚合物，而蛋白質被破碎成更小微粒。壓力達到120 MPa時，其圖像與40 MPa下相似，但其絲狀網絡結構部分被破壞，其粗細不均勻，顆粒較大。160 MPa下的大豆分離蛋白由于超高壓力、高剪切力及空穴作用，其形成大量的不規則小顆粒和玻片，其形貌基本與80 MPa壓力下的大豆分離蛋白形貌相似。

圖5 0.1，20，40，80，120和160 MPa處理大豆分離蛋白的掃描電鏡圖

上述變化表明，經動態高壓微射流處理的大豆分離蛋白的樣品顆粒形貌發生較大變化。隨著壓力升高，大豆分離蛋白的破碎程度發生不同變化，并聚集程度也有所變化。壓力達到160 MPa時，大豆分離蛋白徹底被破壞成為細小顆粒，其現象均與大豆分離蛋白的粒度變化和蛋白質的二級結構變化相一致。

3 結論

隨著壓力升高，大豆分離蛋白的粒徑逐漸減小，在不同壓力下的大豆分離蛋白平均粒徑與常壓下（0.1 MPa）大豆蛋白溶液相比有顯著性差異（p＜0.05），動態高壓微射流下的大豆分離蛋白Zeta電位與常壓下大豆分離蛋白相比有顯著性的差異（p＜0.05）；隨著壓力升高，其溶解性也逐漸升高，壓力超過40 MPa后，其溶解性不再隨壓力變化而變化；傅里葉紅外光分析發現動態高壓微射流處理大豆分離蛋白并沒有產生新的化學結構和功能性基團，但分子中的特殊官能團的含量發生變化，造成蛋白質的二級結構的變化；不同壓力下的大豆分離蛋白顆粒形貌發生較大變化，隨著壓力升高，其破碎和聚集程度均發生變化。