牛奶過敏原主要檢測技術和消減方法研究進展

吳佰林，尤亮亮，賈曉玲，邵偉平，安保森

青島新希望琴牌乳業有限公司（青島 266300）

除人類母乳以外，牛奶是一種營養成分最齊全、營養價值最高的液體食品，被稱為白色血液。牛奶營養全面，含有大量的蛋白質、脂肪、糖類以及多種氨基酸，鈣、磷、鐵等微量元素，其維生素、酶和抗體等也非常豐富，易被人體消化、吸收和利用。然而，牛奶富含乳糖，因此其也是一種易引起過敏反應的食品。過敏反應，是指機體受到同一種抗原再次刺激后所產生的一種組織損傷或生理功能紊亂的特異性免疫反應。過敏反應發生率在不同人群中存在差異，通常情況下兒童的過敏率要明顯高于成年人。有報道顯示，我國兒童過敏發生率為5.83%，其在性別上無明顯差異，但在地域上存在顯著性差異。拉薩市兒童過敏發生率最低，僅為2.33%，青島市兒童過敏發生率最高，為9.11%，這可能與青島當地喜歡食用海產品有關[1]。近年來，食品過敏原研究進展的介紹相對較多，主要集中在農副產品上，而有關牛奶及乳制品過敏原的綜述較少。通過歸納牛奶中主要過敏原的理化性質及特點，總結牛奶中主要過敏原的檢測技術及研究進展，介紹牛奶過敏原的消減技術，以期為牛奶過敏原的消減控制提供理論依據和指導。

1 牛奶中主要過敏原

奶及奶制品是一類易引發過敏反應的食品。一方面，因為奶制品中含有大量的酪蛋白、乳白蛋白和乳球蛋白；另一方面，這些蛋白在人乳和牛乳中含量存在差異，此類蛋白能引發機體出現皮膚病、胃腸道不適、哮喘等癥狀。人乳和牛乳主要蛋白組成及其含量的差異情況如表1所示。

表1 人乳和牛乳主要蛋白組成 單位：mg/mL

從表1可以看出，牛乳和人乳蛋白在組成成分上具有較大的相似性，但兩者在各組分的含量方面存在較大差異。有報道顯示牛奶中的主要過敏蛋白為α-s1-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。

牛乳蛋白中的主要成分為α-s1-酪蛋白，是一種由199個氨基酸組成的高度磷酸化蛋白，可促進金屬離子在人體內的吸收。由于該蛋白不存在于母乳中，但廣泛存在于哺乳動物的乳汁中，使得部分嬰幼兒在飲用相關奶制品后出現過敏癥狀。因此，α-s1-酪蛋白被認為是牛乳中一種主要的過敏原。

作為一種天然的乳清蛋白，α-乳白蛋白屬于小分子蛋白，其是唯一能與鈣結合的乳清蛋白，廣泛分布于人和哺乳動物的乳汁中。α-乳白蛋白的含量為牛奶總乳清蛋白的19%左右，與人乳氨基酸組成相同率達到74%，亦有6%組成與人乳極為相似，因此α-乳白蛋白的穩定性較好，可作為人體必需氨基酸和多種支鏈氨基酸的理想蛋白來源。

另外，牛奶中的β-乳球蛋白是具有A、B、C三種結構的一類蛋白，三種結構和性質與體系pH具有很大的關系，其占總蛋白的7%～12%。研究表明在降低膽固醇與抗氧化等生理功能方面，β-乳球蛋白水解的產物和分子修飾物具有重要作用。此外，有報道顯示β-乳球蛋白還可以發揮免疫球蛋白的類似功能。然而，該類蛋白不存在于人乳中，且嬰兒的消化系統發育尚不完全，因此β-乳球蛋白易引起嬰兒的過敏反應。

2 牛奶蛋白過敏原檢測技術

目前，關于牛奶蛋白過敏原檢測的技術可以歸納為蛋白水平-免疫學檢測和基因水平-分子生物學檢測。其中，蛋白水平-免疫學檢測主要包括酶聯免疫吸附法和免疫層析技術，基因水平-分子生物學檢測主要為實時熒光定量技術和環介導等溫擴增技術。

2.1 蛋白水平-免疫學檢測

2.1.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一種根據酶聯免疫原理，利用抗原抗體特異性結合的檢測方法。ELISA技術通過連接到抗體上的酶對結合的抗原和抗體進行檢測；檢測過程中無色底物變成顯色產物，從而指示存在抗原-抗體復合物[2]。近年來，越來越多的ELISA檢測牛乳中蛋白過敏原的方法被建立，包括α-s1-酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白[3-5]。高淑霞[6]分別制備了抗牛乳全蛋白和β-乳球蛋白的兔多克隆抗體和鼠多克隆抗體，通過優化檢測條件以及抗體校價和制備標曲等，分別建立了針對牛乳全蛋白和β-乳球蛋白的間接競爭ELISA檢測方法。潘麗[7]利用金磁酶聯免疫法檢測牛乳過敏原酪蛋白和α-乳白蛋白，結果發現這種方法的特異性、精密度和穩定性均較好，對CN和α-LA的回收率分別達到82%～105%和87.1%～111%，滿足CN/α-LA檢測的相關要求，對于食品安全檢測具有重要的實踐意義。ELISA不僅在牛奶過敏原檢測中具有實際應用，還用于其他食品過敏原的檢測。張潔瓊等[8]利用提取的中國甜杏仁的過敏原蛋白、苦杏仁球蛋白分別制備兔和鼠的多克隆抗體，以此建立了雙抗體夾心ELISA檢測方法，結果表明該方法不僅檢測限低且特異性良好。隨后利用該方法檢測法式小面包、餅干和脫脂牛乳中杏仁過敏原，結果發現苦杏仁球蛋白的添加回收率達到78.94%～125.15%，并且均得到低于5.81%的相對標準偏差。這些研究表明ELISA方法不僅已經較好地應用于牛乳蛋白過敏原和其他食品過敏原的檢測當中，而且具有高效準確等特點，檢測效果良好。

2.1.2 免疫層析技術

免疫層析法（immunochromatography as say，ICA），其原理是把特異抗體先固定在硝酸纖維素膜上的某一區域，檢測時干燥硝酸纖維素的一端浸入待測樣品后，利用毛細管作用，樣品會沿著膜向前移動，直至移動到有抗體固定的區域，樣品中對應的抗原與抗體產生特異性結合，進一步用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區域顯色，從而實現特異性的免疫診斷。免疫層析法在乳制品過敏原檢測方面的研究相對較少，但在其他食品過敏原檢測的應用十分廣泛[9]。李夢銀[10]制備及鑒定了小清蛋白單克隆抗體，進而制備了金磁復合納米微粒，最后建立了小清蛋白金磁ICA檢測方法，結果發現小清蛋白金磁ICA試紙條定量檢測可以通過建立T/C比值的定量方法提高檢測靈敏度。吉坤美等[11]報道了一種用于檢測食品中花生蛋白成分的簡易快速膠體金免疫層析法（GICA），通過自制花生抗原標準品，檢測GICA方法的靈敏度，并檢測19種食品花生蛋白含量。結果表明：GICA測試條與花生蛋白抗原呈特異性反應，檢測標準品的靈敏度為50 ng/mL，且檢測結果與所檢食品過敏原標識基本一致。此外，劉悅[12]建立了單一檢測卵轉鐵蛋白、杏仁過敏原蛋白、花生過敏原蛋白的GICA試紙條，以此為基礎又建立了能同時檢測杏仁、花生兩種堅果過敏原蛋白的GICA試紙條，結果表明該方法操作便捷、結果易讀，可應用于大量樣品的快速檢測。

2.2 基因水平-分子生物學檢測

2.2.1 實時熒光定量技術

實時熒光定量技術（quantitative real-time PCR，qPCR）是基于熒光化學物質來測定每次聚合酶鏈式反應循環后產物總量的方法，是用于檢測食品過敏原最為廣泛采用的檢測方法之一[13]。賈敏等[14]報道，運用qPCR檢測牛奶中β-乳球蛋白質的含量，標準曲線的Ct值與檢測模板濃度的線性關系良好，其相關系數為0.997 8，運用此方法檢測具有靈敏度高、特異性強和穩定性好等特性，組內和組間的變異系數均小于5%。檢測10種食品牛奶過敏原，結果發現試驗結果與標簽描述吻合，說明所建立的qPCR方法可用于檢測食品中牛奶過敏原β-乳球蛋白質含量。qPCR不僅用于牛奶過敏原的檢測，還廣泛應用于其他食品過敏原的檢測。尚柯等[15]構建了小麥和榛子的過敏原基因數據庫，通過數據庫查詢特異性序列并設計定量引物，建立了一種快速、便捷、高效的檢測過敏原的方法，結果發現該方法對應過敏原成分鑒定能夠達到理想效果，檢出限為1%，且重復性好，準確率高。此外，張舒亞等[16]將大豆過敏蛋白P34作為靶標，利用TaqMan探針qPCR技術建立了大豆成分過敏原的檢測方法。研究顯示建立的檢測方法檢測限為10 mg/kg，特異性和靈敏度較好。這些研究表明qPCR方法已經較好地應用于牛乳蛋白過敏原和其他食品過敏原的檢測當中。

2.2.2 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）作為一種全新的擴增核酸的方法，其可以在等溫條件下短時間內進行核酸擴增[17]。LAMP技術進行基因擴增，具有簡便、快速、精確和低廉等特點，被廣泛應用于分子生物學檢測。Kim等[18]將LAMP技術用于同時檢測牛奶和山羊奶的雙重環介導等溫擴增測定法，檢測時間縮短至30 min，山羊奶、山牛奶的檢測限可分別達到2%，不像普通PCR方法需要進行凝膠電泳觀察結果，LAMP技術是一種適合現場、基層快速檢測的方法。LAMP技術還被廣泛應用于其他食品過敏原的檢測。張懿翔等[19]利用LAMP方法檢測食品中的過敏原牡蠣成分，結果檢測出0.01 ng/μL的DNA待測樣品中含有0.1%的牡蠣成分，大幅縮短檢測用時。程晉霞等[20]建立了LAMP檢測食品過敏原芥末成分，并與qPCR檢測方法進行比較，結果表明LAMP的檢測靈敏度與qPCR相當，為0.5%。

3 牛奶過敏原消減技術

根據脫敏機理進行分類，國內外主要將脫敏方法分為3種：物理消減技術、化學消減技術及生物消減技術。物理消減技術主要包括熱處理、輻照、超聲等方法；化學消減技術主要包括糖基化法；生物消減技術主要包括酶解法。

3.1 物理消減技術（熱處理、輻照、超聲）

3.1.1 熱處理

蛋白質的功能主要由其結構特性決定，因此蛋白質結構和構象一旦發生改變，就意味著其功能的變化。熱處理會使得蛋白質變性，且變性程度隨著加熱溫度不同進而發生變化，中等溫度的熱變性會不同程度降低蛋白質的生物活性，較高溫度的熱變性會導致蛋白質生物活性完全喪失[21]。Bu等[22]研究不同溫度下熱處理對牛乳過敏原β-乳球蛋白的致敏性變化，結果表明加熱至90 ℃時會促進β-乳球蛋白分子展開，使構象表位暴露面積增大，對蛋白水解的敏感性增強，從而導致過敏反應的增加。但當加熱溫度升高至100℃和120 ℃時，其可掩飾或者破壞構象表位并降低變應原性。吳序櫟[23]將熱處理應用于β-乳球蛋白消減技術的研究，并對比了β-乳球蛋白在單一預熱處理和預熱處理后與結合沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的免疫反應情況，結果表明預熱處理后β-乳球蛋白與EGCG結合，并且結合能力增強。此外，蛋白免疫反應性的降低程度大于單一的熱處理蛋白。史曉霞等[24]報道了蛋清卵類粘蛋白在熱處理下過敏原性和構象的變化，結果發現卵類粘蛋白熱處理后降低了過敏原性，且隨溫度的升高和時間的延長，過敏原性不斷降低。

3.1.2 輻照

研究顯示輻照可以造成蛋白質氨基酸間的斷裂、交聯以及分子構象變化，引起過敏原表位發生破壞，進而影響過敏原與相應抗體的結合能力，改變過敏原的致敏性，因此，輻照有可能成為降低或消除食物過敏反應的重要技術[25]。孫軒夷[26]選取牛乳α-乳白蛋白為模式蛋白，利用輻照加工處理α-乳白蛋白，評估α-乳白蛋白加工前后致敏性的變化，結果發現輻照使α-乳白蛋白的致敏性明顯降低。白雨鑫等[27]利用輻照對牛乳β-乳球蛋白進行處理，結果發現經過輻照加工后β-乳球蛋白可以形成聚合物，同時蛋白變為無序結構，表面的疏水性和色氨酸熒光強度均發生明顯變化，認為其主要破壞了β-乳球蛋白的構象性表位，從而顯著降低其抗原性和過敏原性。

3.1.3 超聲處理

超聲波是一種彈性波，其在媒質中可以形成介質粒子的機械振動，這種超聲波振動具有能量所引起的與媒質的相互作用，能夠產生機械效應、熱效應和空化效應等多種效應，進而造成物質的結構變化，因此近些年在食品過敏原消解領域應用廣泛，然而牛奶過敏原消減中應用的研究報道少[28]。鄧涵等[29]利用超聲波對大豆7S蛋白進行改性處理，并評估超聲處理產物體外消化性及消化產物抗原性和潛在致敏性的變化，研究發現80 min的超聲處理大豆7S蛋白的潛在致敏性明顯下降。劉妍妘等[30]報道，以大黃魚魚卵為檢測原料，比較多種加工方式包括美拉德反應、紫外照射、超聲聯合加熱和高溫高壓等對大黃魚魚卵過敏原和其消化產物免疫反應性的影響，結果表明超聲聯合加熱處理使得過敏原消化產物的IgE結合活性明顯減弱。

3.2 化學消減技術

化學法主要利用糖基化方法來使致敏原活性降低，糖基化方法是運用蛋白質與糖類之間的美拉德反應對乳清蛋白進行改性，生成糖基化產物，實現抗原活性部位的改變，這種化學改性已經應用于降低牛乳蛋白抗原性的實踐[31]。Li等[32]通過美拉德反應實現麥芽五糖和乳清分離蛋白（whey isolate protein，WPI）的糖基化，探究了乳清蛋白多糖復合物的免疫原性。Kobayash等[33]對β-LG與羧甲基葡聚糖進行接枝改性，生成的β-LG-羧甲基葡聚糖可以保持維生素E結合活性，其熱穩定性高且無過敏性。糖基化反應還在降低其他食品致敏性具有廣泛的應用，朱婷偉[34]報道大豆蛋白過敏原糖基化修飾后抗原性變化，結果表明糖基化反應影響了抗原性，其關鍵作用是蛋白與糖結合部位影響了蛋白質結構的改變。此外，阮韋偉[35]報道糖基修飾改性可明顯影響擬穴青蟹主要過敏原精氨酸激酶與原肌球蛋白的致敏性。

3.3 生物消減技術

生物消減技術主要采用酶法對乳及乳制品進行相應處理。石徑等[36]利用6種乳酸桿菌粗提酶液于37 ℃對脫脂乳進行酶解，并采用ELISA方法測定α-LA、β-LG、α-CN和β-酪蛋白（β-CN）共4種乳蛋白在酶解脫脂乳中的抗原性和過敏原性，結果表明雖然不同菌種所產酶液均能一定程度地消減不同乳蛋白抗原性與過敏原性，但其影響程度存在差異。路雪蕊等[37]采用響應面法優化酶法對小麥粉的致敏性，研究顯示酶活比為2∶5的菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶，6.64%的復配料液比，在pH 6.53和溫度47.7 ℃條件下酶解，酶解2.47 h，加酶量為0.395 g/100 g蛋白質，此條件下過敏原含量為0.593 μg/g蛋白質，檢測結果與理論值相差7.8%，致敏性降低至原來的63.9%，實現小麥粉致敏性顯著降低。

4 結語與展望

牛奶及奶制品過敏原仍然是當今世界上一大熱點議題，對個人的生命安全帶來巨大的隱患、對家庭的財產安全帶來巨大的負擔，因此找到有效的過敏原檢測技術及消減技術迫在眉睫。

牛奶及乳制品過敏原的檢測技術主要包括蛋白水分和基因水平兩大類，目前許多學者將該兩類檢測技術應用到相關食品進行研究并進行效果驗證，研究結果證實這兩類檢測方法準確有效，因此已經被應用于牛奶及奶制品過敏原的檢測。與牛奶及奶制品過敏原檢測技術相比，消減技術則顯得更為復雜。一方面，過敏原消減技術是對整批產品采用相應的物理、化學或微生物方法進行處理，若操作不當，則可能造成整批產品報廢，帶來巨大的經濟損失；另一方面，實際生產受生產條件、產量、參數及設備等因素的交互影響，這些消減技術在實際生產中能否取得實際應用，還有待進一步實踐和驗證；最后，國內相當一部分工廠的財力有限，無法支撐相應設備的購置及維護費用。

牛奶及奶制品過敏原的檢測技術和消減技術目前處于一個快速成長的階段，因此還存在著一定的不確定性，需要通過進一步的研究與驗證，使得這些技術在運行成本及產品質量方面均得到有效的控制。