UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定白酒中8種甜味劑

張苗，文紅*，張啟恒，董曼，徐成，黃亞平

1. 湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（武漢 430075）；2. 湖北省食品質(zhì)量安全檢測(cè)工程技術(shù)研究中心（武漢 430075）

白酒之所以具有醇甜之感，主要來(lái)源于糧食發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的醇類，特別是多元醇，因甜味來(lái)自醇基，當(dāng)物質(zhì)的羥基增加時(shí)，其醇的甜味也增加，多元醇都有甜味基團(tuán)和助甜基團(tuán)，如己六醇、丙三醇、丁四醇、戊五醇等[1-2]。品質(zhì)優(yōu)良的白酒由于其復(fù)雜特殊的釀造工藝，在發(fā)酵過(guò)程中就能產(chǎn)生一些醇甜物質(zhì)，但這一切的實(shí)現(xiàn)都需要一定時(shí)間、精良的技術(shù)以及優(yōu)良的原料。而很多技術(shù)工藝不達(dá)標(biāo)、原材料品質(zhì)不好的小酒廠為了讓酒口感變好，可能會(huì)在制造過(guò)程中添加一些甜味劑和其他物質(zhì)來(lái)賦予酒類良好的口感[3-7]。

甜味劑在GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中的定義是賦予食品甜味的物質(zhì)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)白酒中大部分甜味劑都是不得使用的，通過(guò)市場(chǎng)監(jiān)管總局每年抽檢監(jiān)測(cè)公布的白酒不合格數(shù)據(jù)來(lái)看，因?yàn)槌秶褂锰鹞秳┑那闆r占整體不合格率的比重較大，說(shuō)明在白酒的生產(chǎn)過(guò)程中還存在違規(guī)添加甜味劑的情況。因此，建立一種高準(zhǔn)確度、高靈敏度、高效快速的甜味劑檢測(cè)方法，加強(qiáng)白酒中甜味劑的監(jiān)管就顯得尤為重要。

目前國(guó)家抽檢監(jiān)測(cè)白酒中甜味劑的項(xiàng)目主要是甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜和紐甜這8種。通過(guò)查詢相應(yīng)實(shí)施細(xì)則和國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法發(fā)現(xiàn)，這8種甜味劑只有甜蜜素采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，其余的糖精鈉、三氯蔗糖、紐甜這3種甜味劑均采用高效液相色譜法，而現(xiàn)有檢測(cè)甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、阿斯巴甜的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法不適用于白酒的檢測(cè)。

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)檢測(cè)甜味劑的方法主要有液相色譜法[8-9]、離子色譜法[10-11]、毛細(xì)管電泳法[12-13]、電化學(xué)法[14]等，主要以液相色譜法為主。由于不同甜味劑的分子結(jié)構(gòu)式、化學(xué)性質(zhì)和光譜性質(zhì)存在差異，以上方法在測(cè)定這8種甜味劑混合物時(shí)存在一定的缺陷，一般只能用來(lái)分析其中一種或結(jié)構(gòu)相似的幾種甜味劑混合物。其中，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15]因其選擇性強(qiáng)、靈敏度高和抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)在甜味劑的分析檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。然而，已報(bào)道的質(zhì)譜檢測(cè)方法并未完全覆蓋國(guó)家抽檢監(jiān)測(cè)的這8種甜味劑。

試驗(yàn)建立了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)檢測(cè)白酒中8種甜味劑的方法，通過(guò)考察稀釋倍數(shù)和增加加熱凈化的步驟，基本上排除了基質(zhì)效應(yīng)的影響，提升了該方法檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定可靠性。方法簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確可靠，既能確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，又能提高檢驗(yàn)效率。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Waters公司）；分析天平（瑞士梅特勒公司）；渦旋混勻器（德國(guó)IKA公司）；Milli2Q型超純水器（美國(guó)Millipore公司）；恒溫水浴鍋（德國(guó)美墨爾特公司）。

乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙酸銨（色譜純，美國(guó)Sigma公司）；甲酸（色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

對(duì)照品：甜菊糖苷（Stevioside，純度99.7%，CAS號(hào)57817-89-7）、甜菊雙糖苷（Steviolbioside，純度98.7%，CAS號(hào)41093-60-1）、安賽蜜（Acesulfame Potassium，純度99.0%，CAS號(hào)33665-90-6）、糖精鈉（Sodium saccharine，純度99.9%，CAS號(hào)128-44-9）、甜蜜素（Sodium N-cyclohexylsulfamate，純度98.9%，CAS號(hào)139-05-9）、三氯蔗糖（Sucralose，純度99.0%，CAS號(hào)56038-13-2）、阿斯巴甜（Aspartame，純度97.2%，CAS號(hào)22839-47-0）、紐甜（Neotame，純度99.4%，CAS號(hào)165450-17-9），均購(gòu)于上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取10.0 mg甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10.0 mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱中保存。

用移液器分別準(zhǔn)確移取1.0 mL單標(biāo)儲(chǔ)備液于100.0 mL容量瓶中，用水稀釋并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；最后，移取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用空白基質(zhì)配制成一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用前配制。

1.3 樣品前處理

稱取10.0 g（精確至0.01 g）酒樣，置于50 mL燒杯中，在60 ℃水浴中邊加熱邊用玻璃棒攪拌約10 min，殘?jiān)哭D(zhuǎn)移至100.0 mL容量瓶中，用10 mL超純水洗燒杯并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用水定容至刻度并搖勻，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過(guò)濾后備用。如果樣品溶液的甜味劑含量過(guò)高，可根據(jù)實(shí)際濃度適當(dāng)稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為30 ℃；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，10% A；0.5～2.5 min，10% A～90% A；2.5～3.0 min，90% A；3.1～3.5 min，90% A～10% A；3.6～5.0 min，10% A。進(jìn)樣量為5 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離（ESI）源；根據(jù)被測(cè)化合物在正、負(fù)離子掃描模式下響應(yīng)靈敏度的大小，選擇正離子掃描方式或負(fù)離子掃描方式；檢測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。質(zhì)譜采用正、負(fù)離子同時(shí)掃描，去溶劑氣流量為1 000 L/Hr；去溶劑氣溫度為450℃；毛細(xì)管電壓為2.50 kV。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相體系時(shí)的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，所有目標(biāo)化合物均能在5.0 min以內(nèi)出峰，且大部分化合物響應(yīng)比使用其他3種流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)明顯增強(qiáng)，化合物之間分離效果較好。因此，選擇使用乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相體系，此時(shí)8種目標(biāo)化合物分析時(shí)間較短，分離效果好且響應(yīng)高。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

首先采用手動(dòng)調(diào)諧中MS Scan（全掃描）的方式進(jìn)行質(zhì)譜全掃描檢測(cè)，得出被測(cè)化合物的一級(jí)質(zhì)譜圖，找出每個(gè)化合物對(duì)應(yīng)的母離子，通過(guò)調(diào)整毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、去溶劑氣溫度、去溶劑氣流量，找到目標(biāo)母離子最強(qiáng)的信號(hào)，確定母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)。然后打開(kāi)氬氣采用子離子掃描，確定主要離子碎片后，通過(guò)優(yōu)化各個(gè)子離子的碰撞能量，最后得到甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜8種甜味劑的最優(yōu)質(zhì)譜參數(shù)，如表1所示。甜菊糖苷、甜菊雙糖苷、安賽蜜、糖精鈉、三氯蔗糖、阿斯巴甜、紐甜僅在負(fù)離子模式下有很好的響應(yīng)，而甜蜜素在正負(fù)離子模式下均有明顯的響應(yīng)，故采用正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)掃描。使用TQD超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)8種甜味劑進(jìn)行分析，各待測(cè)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 8種目標(biāo)化合物的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

表1 8種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)

由于白酒是以曲類、酒母為糖化發(fā)酵劑，利用淀粉質(zhì)原料，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、陳釀和勾兌而釀制成的酒，基質(zhì)中的雜質(zhì)成分復(fù)雜，以電噴霧電離源為離子源的質(zhì)譜分析可能會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度和靈敏度。在沒(méi)有稀釋的白酒原液中加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的加標(biāo)樣品，以考察基質(zhì)效應(yīng)對(duì)目標(biāo)化合物的影響。結(jié)果表明，白酒樣品受基質(zhì)干擾影響比較大，采用定容溶劑配制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線處理加標(biāo)樣品，大部分的目標(biāo)化合物回收率均低于80%。

為了消除白酒基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物定量的影響，在前處理中加入待處理樣品在60 ℃水浴中邊加熱邊用玻璃棒攪拌約10 min這一步驟，目的是為了除去白酒樣品中沸點(diǎn)較低的醛類和醇類，起到凈化樣品的作用。然后考察白酒稀釋1，2，5，10和20倍后，白酒樣品作為定容溶劑繪制標(biāo)曲曲線。結(jié)果表明，稀釋10倍和20倍的白酒樣品作為定容溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.995，而稀釋倍數(shù)在10倍以下的白酒樣品作為定容溶劑配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均小于0.99。考慮到稀釋倍數(shù)會(huì)影響方法的檢出限和定量限，試驗(yàn)最終采用稀釋10倍的白酒樣品作為空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.3.2 方法的線性范圍、檢出限和定量限

取1.2小節(jié)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以目標(biāo)化合物的定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在考察的線性范圍內(nèi)，8種目標(biāo)化合物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均≥0.995。

通過(guò)向白酒的陰性樣品中添加8種待測(cè)成分，考察方法的檢出限（S/N≥3）和定量限（S/N≥10），不同目標(biāo)物的檢出限為15～30 μg/kg，定量限為50～100 μg/kg（見(jiàn)表2）。

表2 8種目標(biāo)化合物的線性范圍、檢出限和定量限

2.3.3 回收率和精密度

按照1.3小節(jié)的前處理方法，向空白基質(zhì)中準(zhǔn)確加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成4個(gè)水平（50，100，200和500 μg/kg）的加標(biāo)樣品，進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)（n=6），結(jié)果見(jiàn)表3。空白基質(zhì)中8種化合物的平均回收率為80.2%～97.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～9.7%。方法的加標(biāo)回收率和精密度均符合GB/T 27404實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范的要求。

表3 白酒中8種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（n=6）

2.4 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用試驗(yàn)方法對(duì)某酒廠送檢的4種不同類型的原酒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：#1號(hào)樣品檢測(cè)出三氯蔗糖、紐甜、阿斯巴甜、糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素、甜菊糖苷這7種甜味劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是131，1 978，3 174，924，135，128和140 μg/kg；#2號(hào)樣品檢測(cè)出紐甜、阿斯巴甜、糖精鈉這3種甜味劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是540，1 180和101 μg/kg；#3號(hào)樣品檢測(cè)出三氯蔗糖、紐甜、阿斯巴甜、糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素這6種甜味劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是142，2 210，2 880，999，142和121 μg/kg；#4號(hào)樣品檢測(cè)出紐甜、阿斯巴甜、糖精鈉這3種甜味劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是403，1 300和58.2 μg/kg。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定白酒中8種甜味劑的方法。方法靈敏度高、前處理簡(jiǎn)單且回收率良好，適用于白酒中多組分甜味劑的同時(shí)快速定性和定量分析，可以為白酒中甜味劑的檢測(cè)工作提供有力的技術(shù)支持。