QuEChERS/LC-MS/MS法測定三文魚中除蟲脲殘留

劉億婕

福建省食品藥品質量檢驗研究院（福州 350000）

三文魚（Salmon），是鮭科魚類或鮭鱒魚類的商品名稱[1]，屬冷水性溯河產卵洄游魚類[2]。其鱗小刺少，肉質細嫩鮮美，同時營養價值豐富[3-4]，因此深受人們的喜愛。隨著人們對三文魚消費需求的增長，國內外養殖業都在不斷擴大三文魚的養殖規模。在養殖產業化和規模化的同時，寄生蟲病也隨之出現[5]。魚虱病是海水網箱養殖鮭鱒魚類常見的寄生蟲性疾病[6-7]，也是困擾養殖者的一大難題。魚虱大量寄生在魚體，引起魚體糜爛、損傷、出血，甚至死亡，嚴重危害著養殖業。目前對于魚虱病的治療主要有藥浴治療及飼料中預混殺蟲藥物[8]。除蟲脲是一種能抑制靶標害蟲的幾丁質合成而導致其死亡或不育的殺蟲劑，常用于鮭鱒魚類魚虱病的治療[9]。然而除蟲脲的過渡或不合理使用會導致藥物在魚體內的殘留，進而危害人的身體健康。歐盟、挪威、智利和日本都制定了除蟲脲在鮭科魚肉中的最大殘留限量（MRL），而中國尚未制定此限量。

除蟲脲的檢測方法主要有液相色譜法[10-11]、液相色譜-質譜法[12-13]。前處理中常用的凈化方式主要有固相萃取柱凈化法[14]和QuEChERS凈化法[15]。在目前報道的文獻及現行有效的國家標準中，對除蟲脲殘留的檢測主要集中在蔬菜、水果等植物性食品中。劉錦霞等[16]建立了豬肉中苯甲酰脲類的檢測方法。GB 23200.45—2016[12]可適用于雞肉、牛肉、豬肉、豬肝等基質，但是三文魚等鮭鱒魚類水產品中除蟲脲殘留的檢測未見報道。試驗采用QuEChERS法進行前處理，通過高效液相色譜-串聯質譜法測定三文魚中除蟲脲的殘留。該方法簡單、準確、靈敏度高，可用于三文魚中除蟲脲的快速檢測，填補了三文魚等鮭鱒魚類中除蟲脲殘留檢測的空白，同時為國內及進口三文魚中除蟲脲殘留的監測提供了技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

API QTrap5500 液相色譜-串聯四極桿質譜儀，配有電噴霧離子源（美國AB公司）；ExionLC AD高效液相色譜儀（美國AB公司）；XPE206DR分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Vortex 4渦旋混合器（德國IKA公司）；CR21N型落地式高速冷凍離心機（日本HITACHI公司）。

除蟲脲對照品（A Chem Tek公司）；乙腈、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷（色譜純，德國Merck公司）；甲酸、乙酸銨（色譜純，上海阿拉丁公司）；氯化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、硅膠鍵合十八烷基（C18）、石墨化碳黑（GCB），納譜分析技術有限公司；超純水由Milli Q系統制得（美國Milipore公司）；三文魚（市售）。

1.2 標準溶液的配制

將除蟲脲標準品用乙腈稀釋配成1 000 μg/L的標準儲備液，置于4 ℃冰箱保存。試驗時用空白基質溶液稀釋成含除蟲脲質量濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，8.0和10.0 μg/L的系列基質匹配標準溶液。

1.3 樣品前處理

取約100 g代表性樣品，用絞肉機絞碎混勻，裝入干凈的自封袋內，密封并標明編號，于-20 ℃冷凍保存。

準確稱取2 g（精確到0.01 g）試樣，置于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水和2 g NaCl渦旋混勻，樣品充分分散后，加入10 mL 1%甲酸-乙腈，渦旋1 min，超聲提取10 min，以9 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液加入到裝有50 mg PSA的離心管中，渦旋1 min，以9 000 r/min離心5 min，過0.22 μm的濾膜后，上機檢測。

1.4 LC-MS/MS條件

1.4.1 液相色譜條件

Eclipse Plus-C18RRHD色譜柱（2.1 nm×50 nm，1.8 μm）；流動相：純水（A相）、乙腈（B相）；流速：0.3 mL/min；進樣體積：5 μL；柱溫：40 ℃。液相色譜梯度洗脫程序：0～1 min，90% A；1～2 min，90%～5% A；2～3 min，5% A；3～4 min，5%～90% A；4～5 min，90% A。

1.4.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI源），負離子模式（ESI-）檢測，掃描方式為多反應監測（MRM）；離子源溫度：450 ℃；電噴霧電壓：-4 500 V；氣簾氣壓力：35 Psi；霧化氣壓力：55.0 Psi；輔助氣壓力：55.0 Psi；碰撞室入口電壓：-10 V；碰撞室出口電壓：-15 V。

1.5 基質效應

水產品基質復雜，含有較高的蛋白質和脂肪等雜質，易產生基質效應。因此，試驗考察了基質效應對目標化合物的影響。采用提取后加入法[17]，用純溶劑與空白基質提取液分別配制相同濃度的標準溶液，上機測定，根據公式ME=Am/As對基質效應（ME）進行評價。式中Am為魚肉空白基質中除蟲脲的吸光度，As為溶劑中除蟲脲的吸光度。當ME=1時，表示無基質效應；當ME＞1時，表示基質對目標物響應產生增強效應；當ME＜1時，表示基質對目標物響應產生減弱效應。當0.8＜ME＜1.2時，表示為弱基質效應；當0.5＜ME＜0.8或1.2＜ME＜1.5時，表示為中等強度基質效應；當ME＜0.5或ME＞1.5時，表示為強基質效應[18]。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優化

配制50 ng/mL的除蟲脲標準溶液，采用針泵進樣方式將其注入離子源，離子源選擇負離子模式。先找到準分子離子峰[M-H]-（母離子），再對準分子離子進行二級質譜掃描，得到碎片離子信息。選擇豐度較大、丟失合理的子離子分別作為定量離子和定性離子，并對去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數進行優化，使各離子碎片響應強度達到最大。優化后的質譜條件參數見表1。

表1 除蟲脲質譜檢測條件參數

在色譜條件方面，主要對流動相進行了優化。試驗比較了乙腈-5 mmoL/L乙酸銨、乙腈-水、甲醇-水分別作為流動相時對各物質的峰型及響應的影響。結果發現，選擇乙腈-水作流動相時，響應更好，峰型也不會拖尾。所以最終流動相水（A相）和乙腈（B相）進行梯度洗脫。流速為0.3 mL/min，最終組分在5 min內出峰。色譜圖見圖1。

圖1 除蟲脲標準溶液總離子流圖（A）和定量、定性離子流圖（B和C）

2.2 樣品前處理條件的選擇

2.2.1 提取溶劑的選擇

樣品在提取之前先加少量的水，使之分散均勻，便于目標化合物的提取。由于用甲醇提取不利于后續提取液與水相的分層，因此試驗將加標量為10 μg/kg的空白魚肉樣品分別用乙腈、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷提取，考察各提取溶劑對回收率的影響，結果如圖2所示。用正己烷提取時回收率不到10%，不能把除蟲脲提取出來，而用乙腈提取的回收率高于乙酸乙酯、二氯甲烷，且乙腈可沉淀蛋白，同時可減少脂類等弱極性組分的提取，所以初步選擇乙腈作為提取溶劑。由于除蟲脲在酸性條件下比較穩定，因此選擇不同酸度條件下的乙腈提取。比較了0.1%甲酸-乙腈、0.5%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈和5%甲酸-乙腈分別作為提取劑的提取效果，結果（圖3）發現，加入甲酸提取比單獨用乙腈提取回收率更高，且隨著甲酸添加量的增加，回收率也呈增高的趨勢，當甲酸為1%時回收率最高，5%時有所下降，最終提取溶劑選擇1%甲酸-乙腈。

圖2 不同提取溶劑對除蟲脲提取效率的影響

圖3 不同酸度的乙腈溶液對除蟲脲提取效率的影響

2.2.2 凈化劑的選擇

QuEChERS方法中常用的凈化劑有PSA、C18、GCB等。PSA主要用于除去樣品中的脂肪酸、酚類碳水化合物等[19-20]，C18具有良好的除脂能力[21]，而GCB通常用來除去樣品中的色素，同時GCB會吸附一些具有平面及對稱結構的化合物[22]。為考察不同凈化劑的凈化效果，試驗將加標量為10 μg/kg的空白魚肉樣品進行前處理，考察了PSA、C18、GCB及其兩兩組合（保持凈化劑的總量不變）作為凈化劑的凈化效果及對回收率的影響。圖4顯示：當添加GCB時，回收率均很低，說明GCB對目標物有較強的吸附。PSA、C18及其兩者的組合均有較好的凈化效果，但PSA單獨作為凈化劑時回收率略高于C18及兩者的組合，因此選取PSA作為凈化劑。進一步考察凈化劑的用量對回收率的影響。將加標量為10 μg/kg的空白魚肉樣品提取后，考察了25，50，75，100和150 mg PSA分別作為凈化劑對回收率的影響。結果（圖5）表明：50 mg PSA在達到較好的凈化效果的同時也可以滿足較好的回收率，再增加PSA的用量回收率呈下降趨勢，最終選擇50 mg PSA作為凈化劑。

圖4 不同凈化劑對除蟲脲的凈化效果

圖5 不同質量的PSA對除蟲脲的凈化效果

2.3 基質效應

分別用溶劑（10%乙腈水溶液）和空白魚肉基質提取液配制成含除蟲脲質量濃度為10 ng/mL的標準溶液，分別連續進樣3次，以空白基質中除蟲脲峰面積與溶劑中除蟲脲峰面積之比計算基質效應。基質效應評價結果（表3）顯示：除蟲脲在魚肉基質中表現為強基質效應。為確保檢測結果的準確性、降低基質效應對結果帶來的誤差，在實際樣品的檢測中采用基質配標。

2.4 標準曲線、檢出限和定量限

稱取6份陰性魚肉樣品，按前處理方法處理得到空白基質，以空白基質為稀釋劑配制標準曲線，以被測物峰面積為縱坐標，以被測物濃度為橫坐標，進行線性回歸。結果表明：除蟲脲在0.5～10 ng/mL質量濃度范圍內線性良好，線性回歸方程及相關系數見表2。

同時進行檢出限、定量限測定試驗，陰性樣品加標后，按1.3小節的方法處理后上機測定，以信噪比（S/N）3和10分別確定方法的檢出限（SLOD）和定量限（SLOQ），結果見表2。方法檢出限為0.15 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，定量限低于GB 23200.45—2016《食品安全國家標準食品中除蟲脲殘留量的測定》的規定（定量限為10 μg/kg）。

表2 除蟲脲的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限及定量限

2.5 方法回收率和精密度

在魚肉陰性樣品中添加低（5 μg/kg）、中（10 μg/kg）、高（20 μg/kg）3個質量分數水平的標準溶液，按1.3小節的樣品前處理方法進行處理，每個水平的加標試驗做6個平行樣，各水平的加標量和結果見表3。除蟲脲的回收率在87.3%～96.3%之間，相對標準偏差在1.2%～2.2%之間，回收率及精密度良好，符合檢測要求。

表3 除蟲脲平均回收率、相對標準偏差（n=6）及基質效應（n=3）

2.6 實際樣品的檢測

從超市購買5份三文魚樣品，按試驗方法檢測，均未檢出除蟲脲殘留。將5份樣品都稱2個平行樣，并按10 μg/kg質量分數進行加標，前處理后上機得到平均回收率，結果分別為95.4%，92.3%，95.0%，94.3%和93.6%，再次證明該方法的準確性。

3 結論

試驗建立了三文魚中除蟲脲殘留的QuEChERS/LC-MS/MS分析方法。該方法前處理簡單，檢測周期短，基質干擾少，在3個添加水平（n=6）下的回收率為87.3%～96.3%，相對標準偏差為1.2%～2.2%，具有良好的準確度和精密度，方法檢出限為0.15 μg/kg，定量限為0.5 μg/kg，低于GB 23200.45—2016中定量限，也低于歐盟、挪威制定的最大殘留限量。該方法準確、可靠，為三文魚中除蟲脲殘留監測提供了有力的技術手段。