熒光重組酶介導等溫擴增快速檢測食品中沙門氏菌

黃新新，何宇平*，樊彥莉，趙勇，曾靜，鄭秋月

1. 上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心（上海 200135）；2. 上海海洋大學食品學院（上海 201306）；3. 中國海關科學技術研究中心（北京 100026）；4. 大連民族大學（大連 116600）

沙門氏菌是一種常見的食源性致病菌，據統計，在世界各國的細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙門氏菌引起的食物中毒主要表現為惡心、痙攣性腹痛、嘔吐腹瀉、全身發熱等癥狀[1]。在進出口食品及魚粉等飼料中，沙門氏菌也是必檢項目，因此沙門氏菌作為一項重要的食品檢測指標在公共衛生領域被重點關注。與傳統檢測方法費時費力不同，分子檢測技術正受到越來越多的應用和研究。然而普通PCR、熒光PCR存在需要電泳或是設備較大，只能在實驗室使用，無法進行現場檢測；LAMP技術具有特異性不高，容易污染等缺點。

重組酶介導鏈替換核酸擴增技術（recombinaseaided amplification，RAA），是一種可使微量核酸在體外高效快速擴增的新技術。重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列，并使其退火解鏈。單鏈DNA結合蛋白（SSB）與單鏈結合形成D型結構，DNA聚合酶啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。與傳統PCR及等溫擴增技術相比較，其最顯著的優勢是在25～43 ℃條件下，5～20 min內觀察到檢測結果，且操作簡單、設備成本低廉。目前重組酶等溫擴增技術已取得長足的發展，并被應用在病毒、細菌、轉基因、食品安全等多個檢測領域[2-6]。研究開發一種用于檢測沙門氏菌的RAA技術，旨在滿足口岸實驗室及現場檢測的靈敏、簡便、快速和低成本的要求。

1 材料與方法

1.1 菌株

特異性測試包括包含性測試和排外性測試。包含性測試所用菌株為鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、副傷寒沙門氏菌A T C C 9 1 5 0、豬霍亂沙門氏菌ATCC7001、腸炎沙門氏菌ATCC17036、腸炎沙門氏菌ATCC49216、傷寒沙門氏菌CMCC50071；排外性測試所用菌株包括單增李斯特菌ATCC7644、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯氏ATCC13883、產氣腸桿菌ATCC13048、大腸埃希氏菌ATCC29522、金黃色葡萄球菌ATCC6538、糞腸球菌ATCC49452、溶血性鏈球菌ATCC21059、阪崎腸桿菌ATCC29544。除傷寒沙門氏菌CMCC50071購自中國醫學細菌菌種保藏管理中心，其余均購自美國ATCC菌株保藏中心。8株沙門氏菌分離株S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7和S9從實驗室食品中分離鑒定，所有菌株-80 ℃保存于10%甘油肉湯中。

1.2 儀器與試劑

RAA-1620熒光RAA檢測儀（江蘇奇天基因生物科技有限公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。熒光RAA擴增試劑盒（江蘇奇天基因生物科技有限公司）；細菌基因組DNA抽提試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；緩沖蛋白胨水（BPW）、營養肉湯、四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂（北京陸橋技術股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株復蘇

從甘油凍存管中取100 μL菌液接種到5 mL腦心浸液培養肉湯中，在37 ℃條件下，按150 r/min振蕩過夜。

1.3.2 細菌DNA制備

取1 mL細菌培養物至1.5 mL EP離心管，按12 000 r/min離心10 min，收集菌液，棄上清液。按照細菌基因組DNA提取試劑盒方法提取細菌DNA。于-20 ℃保存備用。

1.3.3 引物設計

從NCBI GenBank數據庫中獲得沙門氏菌invA序列，根據RAA引物、探針設計原則設計熒光RAA引物和探針序列。引物、探針由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1。

表1 沙門氏菌RAA擴增的引物探針

1.3.4 引物的篩選

將兩條正向引物與兩條反向引物互相組合，與探針形成四個組合，對引物和探針的濃度進行最佳配比篩選，通過熒光信號值的大小以及反應時間篩選最佳引物、探針組合。

1.3.5 反應溫度的優化

RAA反應液包括正反向引物各2.1 μL（10 μmol/L）、探針0.6 μL（10 μmol/L），2×反應緩沖液25 μL，ddH2O及DNA模板17.7 μL，最后加入2.5 μL乙酸鎂，充分混勻。將RAA反應液在不同溫度（30，35，39和42 ℃）中進行反應，確定最佳擴增溫度。

1.3.6 引物探針濃度的優化

在探針終濃度為120 nmol/L時，將引物終濃度分別稀釋為100，200，300和400 nmol/L；引物終濃度為200和400 nmol/L時，對應的探針終濃度分別稀釋為100，200，300和400 nmol/L進行擴增，比較最佳擴增效果時引物探針濃度。

1.3.7 特異性檢測

鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028以及其余的5株沙門氏菌標準株：副傷寒沙門氏菌ATCC9150、豬霍亂沙門氏菌ATCC7001、腸炎沙門氏菌ATCC17036、腸炎沙門氏菌ATCC49216、傷寒沙門氏菌CMCC50071；以及8株沙門氏菌分離株S1，S2，S3，S4，S5，S6，S7和S9；另外包括單增李斯特菌ATCC7644、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯氏ATCC13883、產氣腸桿菌ATCC13048、大腸埃希氏菌ATCC29522 、金黃色葡萄球菌ATCC6538、糞腸球菌ATCC49452、溶血性鏈球菌ATCC21059、阪崎腸桿菌ATCC29544等菌株純培養物按1.3.2小節提取DNA模板后進行熒光RAA檢測，驗證方法特異性。

1.3.8 靈敏度檢測

挑取營養瓊脂平板上新鮮生長的沙門氏菌ATCC14028單菌落接種于LB肉湯中，24 h后依次吸取1 mL菌懸液于9 mL LB肉湯中，制成10倍梯度稀釋液。分別取100 μL菌液涂布于平板上，于37±1 ℃培養24～48 h，對不同梯度菌液進行計數。從每個稀釋度管子中取1 mL菌懸液提取DNA，進行RAA反應。

1.3.9 基質中檢測限檢測

收集按照GB 4789.4—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 沙門氏氏菌檢驗》檢測為無沙門氏菌污染的牛肉樣品。以比濁法確定最初的菌液濃度為3×108CFU/mL，進行10-1～10-10稀釋。稱取25 g上述樣品，向其中添加不同稀釋度的沙門氏菌純菌液。取1 mL提取DNA做增菌前熒光RAA擴增檢測。將人工污染的樣品加到225 mL BPW預增菌培養基中，置36 ℃條件下培養18 h，取1 mL預增菌液加入到10 mL四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液中。42 ℃條件下分別培養2和24 h后，采集1 mL培養液，提取DNA模板，用熒光RAA法擴增觀察結果。所有做熒光RAA檢測的樣品同時利用GB 4789.4—2016標準方法進行檢測。

1.3.10 實際樣品檢測

按照GB 4789.4—2016對上海市售的肉類、冰鮮等50份進行增菌后，提取基因組DNA，采用建立的熒光RAA方法進行檢測，同時采用GB 4789.4—2016中推薦的傳統劃線培養方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌熒光RAA方法建立及優化

2.1.1 擴增溫度優化

分別選擇30，35，39和42 ℃作為擴增溫度，測試沙門氏菌RAA擴增效果差異。結果表明，39 ℃時擴增熒光度最高，故最佳擴增溫度為39 ℃。

2.1.2 RAA不同引物探針濃度優化

經過優化，探針終濃度120 nmol/L時，引物濃度為200 nmol/L時擴增信號最好；而在引物濃度不變的情況下，隨著探針濃度的升高，擴增信號也隨之上升，故選擇最佳引物終濃度為200 nmol/L、探針終濃度為400 nmol/L。

2.1.3 不同引物探針組合篩選測試

由圖1～圖4可見，F3R4P3（圖1）引物探針對擴增的熒光度最高，在3×102CFU/mL時熒光度依舊有13 500 mV，因而選擇F3R4P3組合。

圖1 引物探針F3R3P3 RAA測試結果

圖2 引物探針F3R4P3 RAA測試結果

圖3 引物探針F4R3P3 RAA測試結果

圖4 引物探針F4R4P3 RAA測試結果

綜上所述，最后確定的熒光RAA最佳反應條件為：緩沖液25 μL、上下游引物（10 μM）各1 μL、探針（10 μM）2 μL、乙酸鎂2.5 μL、DNA模板2 μL、純化水16.5 μL，混勻離心分裝至熒光基礎反應單元中，輕柔手彈使凍干粉充分重溶均勻，短暫離心。向每個反應單元的管蓋上加入2.5 μL乙酸鎂，然后向各反應單元加入DNA模板，充分混勻并離心，將反應管放入熒光檢測儀中39 ℃，反應30 min。

2.2 特異性測試

圖5為引物探針F3R4P3對不同菌株擴增的效果圖。利用該引物探針組合對所有沙門氏菌標準菌株（鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028；副傷寒沙門氏菌ATCC9150；豬霍亂沙門氏菌ATCC7001；傷寒沙門氏菌CMCC50071；腸炎沙門氏菌ATCC17036；腸炎沙門氏菌ATCC49216）均能擴增出熒光信號，其余非沙門氏菌的9株細菌及無菌水均沒有擴增出信號，表明引物探針F3R4P3特異性很好（圖5）。利用該引物探針對8株試驗分離沙門氏菌株進行擴增，也均能擴增出熒光信號（結果未顯示），表明該引物探針可適用于沙門氏菌的檢測。

圖5 沙門氏菌RAA特異性反應結果

2.3 靈敏度測試

圖6表明，沙門氏菌以引物探針組合F3R4P3進行RAA擴增，靈敏度可達3×101CFU/mL。

圖6 沙門氏菌以引物探針F3R4P3進行RAA靈敏度測試

2.4 基質中檢出限測試

牛肉樣品中人工污染不同濃度的沙門氏菌BPW增菌18 h后，再接種TTB二次增菌。BPW增菌前RAA擴增檢測限為3×103CFU/mL（結果未顯示），但經過TTB第2次增菌只需2 h后，RAA對牛肉中沙門氏菌的檢出限即可達到原始添加濃度的3×10-2CFU/mL（圖7），傳統劃線培養法檢出限為3 CFU/mL；TTB增菌24 h后，RAA對牛肉中沙門氏菌的檢出限為3×10-2CFU/mL，擴增值比TTB增菌2 h更高（圖8），傳統劃線培養法檢出限才達到3×10-1CFU/mL。由此可見，RAA靈敏度明顯高于傳統劃線培養法。而且相較于傳統培養法需要24 h后才能觀察結果，RAA反應時間只需10～30 min，因而檢測更為快速簡便。

圖7 牛肉TTB增菌2 h后RAA擴增結果

圖8 牛肉TTB增菌24 h后RAA擴增結果

2.5 樣品中沙門氏菌的實際檢測

按照GB 4789.4—2016對市售的牛肉（15份）、雞肉（15份）、三文魚（10份）和巴沙魚（10份）共50份進行前處理增菌后，提取基因組DNA，采用建立的RAA方法進行檢測，同時采用GB 4789.4—2016中推薦的傳統劃線培養方法進行檢測，結果表明1份牛肉和2份雞肉RAA方法檢測結果陽性，與國家標準GB 4789.4—2016檢測結果一致。

3 討論與結論

RAA技術發展至今，在微生物領域得以廣泛應用。有學者應用RT-RAA法檢測甲型流感病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV），檢測甲型流感病毒靈敏度100拷貝/mL、MERS-CoV假病毒顆粒陽性標準品的靈敏度10拷貝/mL，高于實時熒光RT-PCR方法（102拷貝/mL）；檢測時間（20 min）大大低于實時熒光RT-PCR（90 min）[7-8]，此外也有應用于沙門氏菌、乙型溶血性鏈球菌檢測等的報道[6,9]。

引物組合的篩選對確定最佳RAA反應條件至關重要，研究對沙門氏菌的2條上游引物F3、F4和2條下游引物R3、R4進行了兩兩組合篩選，四組結果差異明顯，最終確定引物F3R4結合探針P3為最佳組合。此外RAA引物探針濃度尤其是探針濃度對擴增靈敏度影響非常大，使用普通濃度的探針，靈敏度通常只有103～104CFU/m；而每50 μL反應體系含2 μL（10 μmol/L）以上探針，即探針終濃度提高到400 nmol/L時，靈敏度可達到101～102CFU/mL，能很好地滿足檢測的需求。研究使用該探針濃度，對沙門氏菌純菌的檢測靈敏度達到3 CFU/mL。相比于Hong等[6]應用RPA方法檢測沙門氏菌，靈敏度高出2個數量級。

實際檢測食品樣品時，沙門氏菌不僅含量少，而且通常情況下受消毒、熱加工及輻射等處理影響，常處于受損狀態，另外食品基質也會影響檢測的靈敏度。在研究中，沙門氏菌純菌的靈敏度達3×101CFU/mL，但在牛肉、巴沙魚等食品基質中則只有3×103CFU/mL，因而需要預增菌。經TTB增菌2 h后熒光RAA的檢測靈敏度即達到原始菌添加濃度的3×10-2CFU/mL。相比于國標法需TTB增菌24 h后再觀察結果，其速度及靈敏度顯著勝出。

重組酶等溫擴增技術填補了傳統培養和依賴溫度設備技術以外的空缺，為現場或低資源環境中檢測沙門氏菌等食源性微生物提供了一種簡便、快速、特異靈敏的方法。這種新技術對在現場和非實驗室環境實現即時檢測，具有潛在優勢。