DNA甲基化水平檢測在胃癌早期診斷中的研究進展*

陳銳澤 綜述，張 勇 審校

1.廈門醫學院臨床醫學系，福建廈門 361023；2.機能與臨床轉化福建省高校重點實驗室，福建廈門 361023

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，目前其發病率在人體惡性腫瘤中排名第五，死亡率更是高居第三[1]。由于缺乏特異性的早期檢測手段，絕大多數患者確診時往往因病情惡化、延誤治療而喪失生命。絕大多數患者由于胃癌早期癥狀輕微而未重視，當身體出現明顯不適時才就診，此時多已發展至進展期胃癌，從而延誤最佳治療時機。據腫瘤數據統計顯示，早期胃癌患者5年生存率可達91%，隨著病情進展，腫瘤細胞侵襲至更深層組織時(如漿膜層、肌層)，患者5年生存率則降至26%[2]。當前，臨床胃癌診斷仍主要依賴于侵入性內鏡檢查和病理活檢[3]。利用侵入性內鏡能直觀地發現并評估病灶且相對無創，但成本及操作要求較高，同時也存在諸多禁忌證，且在孕婦、老年人等特殊群體中依從性不高且易發生并發癥，因此無法作為胃癌早期篩查的有效手段。而病理活檢雖然能夠準確判斷腫瘤大小及其分化程度，但無法較好評估患者整體病情發展狀況，再者活檢為有創檢查，容易出現并發癥，很難作為人群胃癌早期篩查的手段。這些檢測手段的局限性給早期胃癌的診斷造成不少困擾。近年來，血清腫瘤標志物的檢測廣泛應用到臨床，通過檢測血清中相關腫瘤標志物如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA)125、CA19-9，可對部分惡性腫瘤進行篩查[4]，但由于胃癌缺乏特異性標志物，所以該技術在早期胃癌診斷中仍存在局限性。

CHEN等[5]研究發現，多數消化道腫瘤患者血漿中的脫落循環腫瘤細胞DNA(ctDNA)具有特異的甲基化水平，能夠及時且高效地對胃癌、結直腸癌等多種消化系統常見腫瘤進行早期診斷，從而極大提高癌癥患者早期生存率。同時，PHALLEN等[6]檢測結直腸癌患者的血漿發現，患者血漿中ctDNA水平明顯高于健康個體，因此對血漿中ctDNA進行分析可能有利于識別腫瘤相關特異性改變[6]。隨著對表觀遺傳學研究的不斷深入，人們在胃癌細胞中也能檢測到DNA異常甲基化，部分調控細胞基因啟動子區異常高甲基化可導致細胞中的抑癌基因失活[7]，從而導致細胞異常生長，而這對早期胃癌的診斷和預后意義重大。通過檢測體內特異性基因異常甲基化程度有望成為一種胃癌早期無創性的檢測手段，從而較大程度提高胃癌患者早期檢出率。本文擬就當前DNA甲基化水平檢測在胃癌早期診斷中的研究進展進行綜述，以期為尋找胃癌早期診斷分子標志物提供新思路。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化指甲基基團在DNA甲基轉移酶(DNMT)的催化作用下添加至胞嘧啶第5號碳的殘基上的修飾過程[8]，該過程多發生于富含胞嘧啶和尿嘧啶的CpG島(即具有高密度胞嘧啶-鳥嘌呤2種核苷酸的DNA區域)中。DNA甲基化是細胞生長發育過程重要的調控機制。有研究表明，DNA異常甲基化與多種惡性腫瘤的發生之間關系密切，尤其與細胞分裂相關的原癌基因、抑癌基因和DNA損傷修復基因[7]。DNA異常甲基化即抑癌基因啟動子區的高甲基化及原癌基因廣泛區域的低甲基化，其中高甲基化多發生于抑癌基因的5′端啟動子區域的CpG島上[9]，該區域上累積的高水平甲基胞嘧啶使抑癌基因失活，或致使調控細胞周期機制的相關蛋白如p27表達下調，從而導致細胞過度生長[10]；而低甲基化多發生于全基因組的原癌基因區域[11]，大量的原癌基因低甲基化導致原本應當沉默的基因被異常激活，從而增加DNA信息傳遞過程中的不穩定性，加速腫瘤的演進。通常DNA低甲基化與抑癌基因高甲基化往往是相伴發生的，只是發生區域有所不同。目前對人類Runt相關轉錄因子-3(RUNX3)基因、hMLH1基因、RASSF1A基因和SEPTIN9基因的高甲基化與胃癌的發生機制研究較多。

2 DNA高甲基化與胃癌發生的相關機制

DNA異常甲基化可能與腫瘤細胞的發生、轉移和侵襲關系密切[12]。正常機體內的各種細胞新陳代謝受多種基因共同調控，其中與腫瘤細胞密切相關的包括原癌基因和抑癌基因。后者在細胞周期、DNA損傷修復、細胞分化等過程中均起到重要作用。體內DNA異常甲基化主要發生在富含CpG島的啟動子區域，該區域的異常高甲基化會阻礙轉錄因子與啟動子結合，從而使抑癌基因無法轉錄或者轉錄水平降低。抑癌基因的沉默易導致胃癌細胞生長分裂不受控制，甚至使腫瘤細胞有更多機會脫離原位細胞基質侵襲擴散至外周，從而促進胃癌的進一步發展[12]。

3 胃癌中幾種常見異常甲基化的基因

3.1RUNX3基因 RUNX3基因主要位于人染色體1p36.11，其表達的RUNX3蛋白是轉化生長因子-β(TGF-β)信號轉導通路中Runt轉錄因子的重要組成部分[13]，同時RUNX3蛋白也是重要的腫瘤抑制因子[14]，其在細胞分化、細胞周期調控、細胞凋亡和惡性轉移過程中意義重大。有研究表明，RUNX3蛋白能夠調節胃黏膜上皮細胞的增殖和凋亡過程[15]，抑制正常胃組織細胞過度生長。而RUNX3基因啟動子區域高甲基化會導致該蛋白表達下降，同時降低TGF-β信號轉導通路敏感性。LU等[16]對胃癌患者血清中游離RUNX3基因啟動子區DNA甲基化程度檢測發現，該基因在胃癌細胞血清中的甲基化水平高達75.2%。HU等[17]對比正常胃上皮組織與胃腫瘤組織發現，RUNX3基因啟動子區域甲基化程度與胃腫瘤細胞侵襲深度呈正相關。因此，RUNX3基因有望成為胃癌早期診斷的重要標志物[18]。

3.2hMLH1基因 hMLH1基因位于人染色體3q21-23，是人類DNA修復基因中的重要成員[19]，它能夠編碼DNA錯配修復酶，從而調控細胞內源性修復功能，維持基因組的穩定性。同時，當機體DNA大量損傷時，hMLH1基因編碼的修復酶能夠進一步被激活，修復錯配的堿基對，防止DNA損傷的累積，從而抑制癌細胞的發展。有研究表明，hMLH1基因啟動子區異常高甲基化是正常胃黏膜細胞發生微衛星不穩定性(MSI)現象，甚至發展為胃癌的重要因素[20]。因此，檢測標本中hMLH1基因甲基化程度對胃癌早期診斷有重要意義。WANI等[21]研究發現，hMLH1基因在胃癌中的甲基化率為72.9%，同時YE 等[22]對2 182例胃癌病例及對照組進行Meta分析發現，胃癌組織或血清中hMLH1基因啟動子異常甲基化與胃癌發生呈正相關，且在腫瘤中晚期(發展至淋巴結轉移)表達明顯下調，表明hMLH1基因啟動子甲基化常發生在胃癌的發展階段，且隨著胃癌由癌前病變到腫瘤的發展過程中甲基化程度不斷升高。因此，hMLH1基因甲基化程度或可作為胃癌診斷的指標之一。

3.3RASSF1A基因 RASSF1A基因屬于ras家族的重要組成部分，其主要通過抑制細胞周期蛋白D1從而引起細胞周期阻滯，限制細胞無限制地分裂生長[23]。以胃癌為主的原發性腫瘤細胞中常能夠捕捉到RASSF1A基因的高甲基化[24]，而在腸化生、胃腺瘤等其他胃疾病中均未發現其異常甲基化的發生。對比不同腫瘤TNM分期患者胃癌細胞RASSF1A甲基化程度發現，Ⅲ和Ⅳ期胃癌患者胃癌細胞甲基化頻率明顯高于Ⅰ和Ⅱ期胃癌患者胃癌細胞[25]，因此RASSF1A基因甲基化程度可能與胃癌分期聯系密切，可作為胃癌診斷及治療效果的監測指標之一。

3.4SEPTIN9基因 SEPTIN基因可分為13種亞型，其中位于17q25.3的SEPTIN9基因與多種原發性腫瘤的發生密切相關。腫瘤細胞SEPTIN9基因5′端的CpG島多可檢測出異常高甲基化[26]。由SEPTIN9基因表達的SEPTIN9蛋白能調控細胞生長，防止其生長過快或不受控制性生長。而當SEPTIN9基因啟動子區因高水平甲基化而沉默時，基因表達停止，正常細胞便不斷向腫瘤細胞方向發展。SEPTIN9基因高甲基化的檢測已應用于結直腸癌的早期篩查、診斷、病理分期乃至術后預后判斷中[27]。有研究發現，胃癌的發生與SEPTIN9基因聯系密切，這可能與SEPTIN9蛋白參與胃癌發展中的MSI現象密切相關[26]。隨著對該基因與胃癌關系更深入的研究，SEPTIN9基因有望成為胃癌早期診斷的指標之一。

4 DNA甲基化水平檢測技術的進展

4.1甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP) MSP是傳統的DNA甲基化水平檢測技術，其針對特定甲基化位點兩端設計引物，以亞硫酸鹽化的待測樣品為模板(亞硫酸化可將未甲基化的胞嘧啶可轉化為尿嘧啶)，利用實時定量PCR技術，實現待測標本甲基化水平的定量分析。由于DNA異常甲基化在腫瘤細胞中常有發生[28]，因此MSP在腫瘤監測中簡便快捷，靈敏度較高。但由于定量PCR技術依賴于標準曲線進行絕對定量，因此要求所測基因需要有標準品。這給甲基化水平檢測造成了一定的局限性。

4.2數字PCR(dPCR) dPCR技術能夠將標本均勻分隔后隨機分配至不同腔室內進行檢測，依據泊松分布的原理實現檢測結果絕對定量[29]。dPCR能夠不依賴標準品實現甲基化水平檢測結果的絕對定量。同時，dPCR能夠極大地提高DNA甲基化水平檢測的特異度和靈敏度。但是，dPCR局限于測定DNA上單一位點的甲基化水平，不能實現高通量的多位點甲基化水平測定。

4.3二代測序(NGS) NGS主要依據DNA測序技術能夠檢測標本中的DNA片段的序列及其含量，具有極高的檢測通量及靈敏度。對標本進行亞硫酸鹽處理后能夠實現特定基因的甲基化水平檢測。該技術能有效克服待測標本DNA含量少、檢測位點單一等問題，實現甲基化水平檢測微量化、高通量化，壓縮了檢測時間。此外，隨著基于分子條形碼(UMI)超深度NGS(即針對不同標本加入特異性堿基序列，從而分辨識別假陽性標本)的發展，NGS檢驗的靈敏度和特異度也在不斷提高[30]。然而，該方法成本高昂，不適宜大規模推廣[31]。

5 小結與展望

隨著對表觀遺傳學的深入探討，越來越多的研究支持人體內DNA異常甲基化與胃癌的發生關系密切。然而，異常甲基化導致胃癌的機制尚未完全闡明，仍需要大量的隨機對照研究來佐證。此外，DNA異常甲基化與不同腫瘤發生之間也存在非特異性和不統一性。因此，胃癌的早期診斷仍需更高特異度的DNA異常甲基化水平模型支持輔助診斷。加強對胃癌DNA異常甲基化位點的研究，更深入研究特異性分子標志物在胃癌發生中的機制意義重大。此外，DNA甲基化水平檢測缺少同時具備高特異度和靈敏度的分析方法，MSP、dPCR及NGS法檢測基因甲基化水平各有短板，深入探索更多特定甲基化位點，定制胃癌特異性DNA甲基化水平檢測基因芯片或有望克服現階段的弊端。同時，DNA異常甲基化水平的檢測不僅對胃癌早期診斷有幫助，在相關腫瘤的治療、預后判斷中也發揮重要作用[26]。目前，SEPTIN9基因異常甲基化水平已運用于判斷結直腸癌治療的預后[27]。因此，進一步闡明DNA異常甲基化在胃癌中的機制，探索特異性的分子標志物不僅能提高胃癌的早期診斷率，還能夠輔助判斷癌癥進展，為臨床治療提供更多幫助。