泛素降解途徑蛋白、堿性成纖維細胞生長因子及凋亡抑制蛋白在前列腺癌中的表達及與臨床病理特征的相關性

肖 榮,于 佳,楊元強,曾振華

前列腺癌是指發生在前列腺的上皮性惡性腫瘤，好發于中老年男性[1]。由于前列腺癌起病較隱匿，生長較緩慢，因此早期常被漏診或誤診；而一旦出現癥狀，常屬較晚期的進展性前列腺癌[2]。近年來，隨著醫學分子研究的不斷創新，分子生物機制在前列腺癌發生、侵襲和轉移中的價值越來越受到關注。

泛素降解途徑在前列腺癌的發生發展中起到重要作用[3]。多項研究表示，泛素降解途徑蛋白[S期激酶相關蛋白2(Skp2)、p27kip1]在惡性腫瘤中異常表達，且與患者預后關系密切[4]。堿性成纖維細胞生長因子(b-FGF)能夠促進間葉細胞、神經外胚層和血管內皮細胞等增殖[5]。凋亡抑制蛋白(IAPs)是一類高度保守的內源性凋亡基因家族表達產物，Survivin是其主要成員，在腫瘤基本的發展過程中扮演著重要角色[6]。本研究就泛素降解途徑蛋白Skp2、p27kip1及b-FGF、Survivin在前列腺癌中的表達及與臨床病理特征的相關性進行分析，旨在為臨床治療提供新靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院病理科于2015年1月—2017年1月保存的行手術切除的前列腺癌組織72例臨床資料。納入標準：均確診為前列腺癌；入組前未接受放療及化療；臨床資料完整且真實。排除標準：合并血液疾病者；嚴重精神疾病或癡呆者；其他原發性惡性腫瘤者；合并風濕免疫及結締組織病變者。70例均符合本研究要求，作為前列腺癌組，年齡38～78(54.37±6.71)歲。同時選取同期本院病理科保存的良性前列腺增生標本60例作為良性組，所有患者無長期藥物治療史且臨床資料完整，年齡35～79(55.11±6.34)歲。2組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法 收集所有患者臨床資料，包括年齡、術前前列腺特異性抗原(PSA)水平、TNM分期、組織分化程度、脈管內瘤栓情況、Gleason評分等。

1.3檢測方法及結果判定

1.3.1檢測方法：腫瘤組織制成石蠟塊，正常組織去除皮下脂肪后固定，石蠟包埋。所有組織切片，厚4 μm，待染。用R-3G54型微波爐(800 W)煮20 min后浸泡在緩沖液中在室溫下冷卻20 min，再次以蒸餾水和PBS緩沖液沖洗。滴加正常山羊血清，直接在切片中加入一抗于37 ℃下靜置30 min后放入4 ℃環境下過夜，次日復溫沖洗浸泡后滴加二抗于30 ℃下靜置20 min，沖洗浸泡后再滴加三抗，于37 ℃下靜置30 min。再次沖洗浸泡后行DAB顯色，于低倍光鏡下控制顯色反應30 min，顯色反應結束后以蘇木素復染核，封片。

1.3.2結果判定標準：Skp2、p27kip1陽性表達著色部位在細胞核，b-FGF、Survivin陽性表達著色部位在細胞漿，呈棕黃色或棕褐色。實驗以PBS代替一抗作為陰性對照：按陽性細胞百分率評分：<25%為1分，25%～50%為2分，≥50%為3分；按染色強度評分：不著色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分[7]。綜合染色陽性細胞數與染色強度判斷結果：陰性(-)0分，弱陽性(+)1～2分，中度陽性(++)3～4分，強陽性(+++)5～6分。兩種計分乘積為每例的加權分數，加權分數為0為陰性，其余均為陽性。讀片均由兩名及以上5年工作經驗的病理科醫師獨立觀察每張切片后共同診斷。

1.4觀察指標 比較2組Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表達情況及與前列腺癌病理參數、預后的相關性。

1.5隨訪方法 本研究隨訪3年，截止時間為2020年1月30日或患者死亡，總生存時間為前列腺癌患者從手術至死亡的時間[8]。

2 結果

2.1前列腺癌組與良性組Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表達情況 前列腺癌組p27kip1陽性表達率低于良性組，Skp2、b-FGF、Survivin陽性表達率高于良性組(P<0.01)。見表1。

表1 前列腺癌組與良性組Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表達情況[例(%)]

2.2Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin與前列腺癌病理參數的相關性 Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin與前列腺癌組織分化程度、TNM分期、Gleason評分及術前PSA水平有關(P<0.01)，與年齡、脈管內瘤栓情況無關(P>0.05)。見表2～3。

表2 Skp2、p27kip1表達情況與前列腺癌病理參數的相關性(例)

表3 b-FGF、Survivin表達情況與前列腺癌病理參數的相關性 (例)

2.3生存組與死亡組Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表達比較 根據患者預后情況分為生存組49例和死亡組21例。生存組p27kip1陽性表達率高于死亡組，Skp2、b-FGF、Survivin陽性表達率低于生存組(P<0.05,P<0.01)。見表4。

表4 生存組與死亡組Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表達情況比較[例(%)]

2.4影響前列腺癌患者預后生存的多因素Logistic回歸分析 術前PSA水平>4 μg/L、中低分化、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、Gleason評分≥7分、p27kip1陰性表達及Skp2、b-FGF、Survivin陽性表達是影響前列腺癌患者預后生存的獨立危險因素(P<0.05,P<0.01)。見表5。

表5 影響前列腺癌患者預后生存的多因素Logistic回歸分析

2.5Skp2、p27kip1、b-FGF、Survivin表達情況與前列腺癌患者預后生存的關系 Skp2、b-FGF、Survivin陽性表達患者生存時間短于陰性組，p27kip1陰性表達患者生存時間短于陽性組(P<0.01)。見圖1～4。

圖1 Skp2表達與前列腺癌患者預后生存的關系

圖2 p27kip1表達與前列腺癌患者預后生存的關系

圖3 b-FGF表達與前列腺癌患者預后生存的關系

圖4 Survivin表達與前列腺癌患者預后生存的關系

3 討論

前列腺癌是我國成年男性多發的惡性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢。臨床實踐發現，前列腺癌對放、化療不敏感，采用內分泌治療一段時間后，癌細胞由雄激素依賴性變為雄激素非依賴性，使腫瘤細胞的增殖無法控制而導致內分泌治療失敗，因此探索基因療法顯得尤為重要[8-10]。

最近研究發現，泛素化與去泛素化的改變和多種腫瘤的發生密切相關，通過調節泛素-蛋白水解酶途徑可以抑制多種腫瘤細胞增殖[11-12]。最近研究表明，Skp2在乳腺癌、結腸癌、鱗癌等惡性腫瘤中表達增加，同時p27kip1蛋白水平降低，且其表達水平的異常改變也提示患者預后較差[13]。而Skp2蛋白是泛素連接酶E3結合磷酸化p27的識別蛋白質，參與p27的泛素化降解[14]。研究發現Skp2在調節正常細胞增殖中起重要作用，此外，其不僅參與p27的降解，同時也參與細胞周期抑制蛋白P21和P30降解[15]。本研究結果顯示，前列腺癌患者p27kip1陽性表達率低于良性組，Skp2陽性表達率高于良性組，且Skp2陽性表達患者生存時間短于陰性組，p27kip1陰性表達患者生存時間短于陽性組。提示Skp2、p27kip1在前列腺癌的發生發展中起重要作用，可作為前列腺癌患者病情發展及預后判斷的指標之一。

b-FGF是堿性成纖維細胞生長因子，在新的基因研究中發現，其作為一種促有絲分裂原，具備促進愈合、修復和生成等功能[16]，同時可刺激細胞增殖、遷移，具有促血管生成作用[17]。而新血管生成是證實腫瘤轉移和侵襲必不可少的條件，故研究該因子在腫瘤中的變化規律對于早期診斷及評估預后有重要意義[18]。本研究結果顯示，前列腺癌組b-FGF陽性表達率高于良性組，且與術前PSA水平、TNM分期、組織分化程度及Gleason評分有關，說明b-FGF可促進前列腺癌的侵襲和轉移。

Survivin是近年研究發現的凋亡抑制蛋白家族的新成員[19]，相關研究顯示，Survivin蛋白對誘導細胞凋亡的細胞色素C及參與細胞生長有抑制作用，同時還能有效阻止參與細胞分化和凋亡的含半胱氨酸蛋白酶家族活化，故分析Survivin蛋白在前列腺癌組織中的表達，對研究前列腺癌的發生、發展及診斷、治療有重要意義[20]。本研究結果顯示，前列腺癌組Survivin陽性表達率高于良性組，說明Survivin蛋白在前列腺癌的形成和發展過程中對細胞凋亡產生了巨大的抑制作用，促進了腫瘤細胞的存活。

綜上所述，Skp2、b-FGF、Survivin陽性表達率及p27kip1陰性表達率在前列腺癌組織中顯著升高，其異常表達與前列腺癌的侵襲與轉移關系密切，可作為預測預后生存的分子標志物和腫瘤治療的潛在靶點。本研究中尚存在一些不足之處，如納入樣本量較少，隨訪方式缺乏臨床驗證，未來可擴大樣本量，加強隨訪真實性。