晚期NSCLC組織巨噬細胞表面Tim-3表達與臨床特征和預后的關系

籍 強， 呂駿卿， 趙 鑫， 榮偉強

(河北北方學院附屬第一醫院1.胸心血管外科，2.急診科，3.放療科，4.輸血科， 河北省張家口市075000)

中國肺癌致死率一直高居首位，主要與早期確診率較低且治療手段有限有關，近年來免疫檢查點分子的發現為腫瘤免疫治療提供了新的思路[1]。美國國立綜合癌癥網指南(NCCN)建議，對于轉移性非小細胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)患者可優先選擇免疫檢查點抑制劑作為二線治療方案[2]。2018年，James團隊因證實阻斷免疫檢查點-細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)和程序性死亡受體-1(programed cell death protein-1，PD-1)可激活機體自身抗腫瘤免疫應答而獲得諾貝爾生理學或醫學獎[3]。T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3，Tim-3)也是本世紀初新發現的一個免疫檢查點分子，在多種免疫細胞表面和實體腫瘤細胞表面都有表達；通過與其相應配體半乳凝素-9(galectin-9，Gal-9)結合介導腫瘤負向免疫調節[4]。但是目前關于Gal-9和Tim-3與肺癌關系的研究尚不全面，本研究旨在檢測晚期NSCLC組織、腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)表面Tim-3表達情況，及與組織Gal-9表達、患者臨床特征和預后的關系，為Tim-3/Gal-9在腫瘤微環境中的免疫應答機制研究提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2017年4月—2018年5月本院病理科保存的80例晚期NSCLC患者的病理組織蠟塊，男62例，女18例，年齡34～79歲，平均(60.41±13.95)歲。納入標準：①病理證實原發性NSCLC；②TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期；③不具備手術指征；④患者簽署知情同意書。排除標準：①小細胞肺癌或非原發NSCLC；②曾接受相關抗腫瘤治療；③合并其他肺部良性病變、其他惡性腫瘤、免疫系統疾病。另外同期選取本院30例肺良性病變手術患者的肺組織蠟塊，男17例，女13例，年齡28～75歲，平均(58.37±15.72)歲；包括肺大皰17例，肺結核11例，支氣管擴張2例；均未合并惡性腫瘤或免疫系統疾病。治療結束后開始電話、規律復診等隨訪1次/月，共隨訪24個月。研究終點為總生存期，即患者從確診當日至隨訪截止時間2020年3月或死亡，隨訪終點死亡患者共58例(72.5%)。

1.2 主要試劑和儀器

DAB染色試劑盒、辣根過氧化物酶標記的兔抗羊(或鼠)二抗(北京中杉金橋生物科技有限公司)。鼠抗人多克隆抗體Gal-9、兔抗人多克隆抗體Tim-3(美國Abcam公司)；FITC-CD68(巨噬細胞表面標志物)、PE-HLA-DR、PE-163、PeCy5-Tim-3(美國Thermo Fisher公司)；Precipoint-M8型全自動數字病理切片掃描儀(德國Proteintech公司)；光學倒置顯微鏡和圖像采集系統(日本Olympus公司)。

1.3 免疫組織化學染色法

取石蠟切片，65 ℃烘烤融蠟，常規脫蠟水化。將切片放入預熱的檸檬酸鈉組織修復液中，高溫高壓煮沸3 min，自然冷卻至室溫；滴加3%雙氧水和山羊血清避光封閉30 min；滴加Tim-3一抗(1∶100稀釋)或Gal-9一抗(1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜；陰性對照采用PBS代替抗體；滴加辣根過氧化物酶標記的兔抗羊(或鼠)二抗；二氨基聯苯胺(DAB)顯色。蘇木精復染，鹽酸-酒精返紅，氨水返藍，脫水晾干后用中性樹膠封片。結果判斷由兩位以上經驗豐富的醫生盲法閱片，鏡下顯示胞膜或胞質出現棕黃色即為陽性染色。參考文獻[5]，將陽性染色細胞百分比對應分值×染色強度作為評分標準，每張切片隨機取10個高倍視野(400×)。>1分為陽性表達，0～1分為陰性表達。

1.4 流式細胞術檢測TAM表面Tim-3表達

取NSCLC患者新鮮腫瘤組織，無菌條件下剪碎消化，經0.45 μm濾膜過濾。收集細胞懸液反復洗滌，加入Ficoll單個核細胞分離液，取中間絮狀物反復洗滌。加入熒光標記的FITC-CD68、PE-CD163/或PE-HLA-DR和PeCy5-Tim-3避光孵育15 min，上機檢測。HLA-DR是M1型巨噬細胞標志物，而M2型巨噬細胞可高表達CD163，因此將HLA-DR+TAM視為M1型，將CD163+TAM視為M2型。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組組織Tim-3和Gal-9蛋白表達的比較

Gal-9和Tim-3蛋白多表達于胞膜和胞質中，偶見胞核中出現棕黃色顆粒(圖1)。NSCLC組織中Tim-3和Gal-9蛋白陽性表達率分別為55.0%和83.75%，肺良性病變組織中分別為33.3%和20.0%；NSCLC組織高于肺良性病變組織(χ2=4.098，P=0.043；χ2=39.718，P=0.000)。

圖1 免疫組織化學法檢測肺組織Tim-3和Gal-9蛋白陽性表達情況(400×)

2.2 NSCLC組織TAM表面Tim-3蛋白的表達

流式細胞術檢測發現，HLA-DR+TAM表面Tim-3陽性表達率低于CD163+TAM[(18.55±6.17)%比(32.56±8.43)%，t=14.369，P=0.000]。將表達率≤平均值視為低表達，>平均值視為高表達，80例NSCLC患者中，HLA-DR+TAM表面Tim-3蛋白呈高表達32例，CD163+TAM表面Tim-3蛋白呈高表達45例。

2.3 NSCLC組織Gal-9表達與組織Tim-3蛋白、TAM表面Tim-3蛋白表達的關系

NSCLC組織Gal-9蛋白和Tim-3蛋白表達一致率為63.75%(51/80)，經Spearman等級相關性檢驗，NSCLC組織Gal-9蛋白和Tim-3蛋白表達呈正相關(r=0.283，P=0.011)。NSCLC組織Gal-9陽性表達者HLA-DR+TAM和CD163+TAM表面Tim-3表達量均高于陰性表達者(P<0.05；表1)。

表1 NSCLC組織Gal-9表達與組織Tim-3蛋白、TAM表面Tim-3蛋白表達的關系

2.4 NSCLC組織TAM表面Tim-3蛋白表達與臨床特征的關系

有肺外轉移、TNM-Ⅳ期和死亡患者HLA-DR+TAM表面Tim-3表達量分別低于無肺外轉移、TNMⅢ期和存活患者，而CD163+TAM表面Tim-3表達量則分別高于無肺外轉移、TNMⅢ期和存活患者(P<0.05；表2)。

表2 不同TAM表型Tim-3蛋白表達水平與臨床特征及預后的關系 單位：%

2.5 不同TAM表型Tim-3蛋白表達與OS的關系

NSCLC患者總生存期為17個月(4～30個月)，HLA-DR+TAM表面Tim-3蛋白高表達患者總生存期長于低表達患者(Log-rank χ2=8.817，P=0.003)；CD163+TAM表面Tim-3蛋白高表達亞組患者中位總生存期則短于低表達亞組(Log-rank χ2=10.913，P=0.001；圖2)。

圖2 NSCLC患者Kaplan-Merier生存曲線圖

3 討 論

近年來，免疫檢查點抑制劑的出現為晚期NSCLC患者帶來了新的希望[1]，目前國內已批準上市多種PD-L1抗體和PD-1抗體，被指南納入用于晚期NSCLC的一線、二線、三線治療[6]。雖然免疫檢查點抑制劑在晚期NSCLC患者中的有效性和安全性已得到眾多研究證實，但是其適用人群有限。Koyama等[7]發現，對于PD-1抗體耐藥的小鼠肺癌模型中，體內T細胞表面Tim-3分子的表達量顯著提高，而給予小鼠Tim-3抗體后，可明顯提高模型小鼠對PD-1抗體的敏感性，因此推斷Tim-3有望成為免疫治療新的靶點。本研究納入的中晚期NSCLC患者均不符合手術指征，遵醫囑接受免疫治療聯合化療，接受PD-1抗體單獨治療的患者極少，多數患者采用聯合化療方案，因此本研究納入的80例患者均為接受化療聯合Nivolumab單抗，通過評估患者2年生存期發現，TAM表面Tim-3分子的表達情況與患者預后密切相關。

Tim-3屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，除了表達于T細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞表面以外，亦存在于巨噬細胞和腫瘤細胞表面[8]。本研究通過免疫組織化學法發現，中晚期NSCLC組織中Tim-3和Gal-9均呈高表達。Gal-9是Tim-3最重要的天然配體之一，Wang等[9]發現Tim-3/Gal-9信號通路可通過調控細胞因子分泌和巨噬細胞極化參與腫瘤的生長和侵襲轉移。TAM是腫瘤微環境中十分重要的免疫細胞，具有高度可塑性，既包含M1型巨噬細胞，也包含M2型巨噬細胞，而TMA表型的動態變化也是影響腫瘤發生、發展的關鍵因素。M1型巨噬細胞(即HLA-DR+TAM)具有抗腫瘤和免疫增強作用，可分泌趨化因子、效應因子等；而M2型巨噬細胞(即CD163+TAM)具有抑制免疫反應、促進血管發生、組織修復和促進腫瘤生長的潛能。例如王位等[10]發現，在炎癥環境中促炎因子或抑炎因子都可影響巨噬細胞表面Tim-3分子的表達情況。張倩倩等[11]提出TAM浸潤與肺腺癌腫瘤TNM分期、Ki67表達密切相關，其作用機制與肺內炎癥微環境有關。Li等[12]研究表明在膠質瘤患者中，外周CD14+單核細胞表面Tim-3呈高表達，而且可促進單核細胞向M2型極化。本研究通過流式細胞術檢測發現，HLA-DR+NTAM表面Tim-3陽性表達量低于CD163+TAM，但是Tim-3表達量和M2型巨噬細胞分化的因果關系尚不能確定，有可能是M2型巨噬細胞分泌的炎癥因子促進Tim-3的陽性表達，也有可能是Tim-3高表達誘導TAM向M2型極化。但是無論如何，Tim-3陽性表達都與TAM向M2型巨噬細胞極化之間存在著密切關聯，在腫瘤細胞肺外轉移以及疾病進展過程中都發揮著關鍵作用。因此腫瘤組織巨噬細胞細胞表面Tim-3有望成為免疫治療的有效靶點，同時對于篩查PD-1/PD-L1免疫抑制劑敏感人群亦可提供可參考的信息。

綜上所述，在晚期NSCLC患者中，Tim-3和Gal-3在腫瘤組織中均呈高表達，Tim-3/Gal-3信號通路在NSCLC肺外轉移以及疾病發展中的作用可能與TAM向M2型巨噬細胞極化導致的肺癌炎癥微環境有關。而且對于接受PD-1抗體聯合化療的晚期NSCLC患者，Tim-3分子在HLA-DR+TAM表面降低且在CD163+TAM表面升高預示著患者2年生存預后不良。本研究為揭示Tim-3作為免疫負性共刺激分子在NSCLC抑制性免疫微環境形成過程中的作用，以及成為下一個用于臨床的免疫治療靶點的研究提供了新的思路。