前列腺癌患者Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及其臨床意義

張建坤， 張 航， 錢亞娜， 李業(yè)山， 董立軍

(河北中石油中心醫(yī)院泌尿外科，河北省廊坊市 065000)

前列腺癌是男性尤其是老年男性常見的惡性腫瘤性疾病，早期篩查其術(shù)后復(fù)發(fā)高危人群，能夠有效降低其復(fù)發(fā)率。前列腺癌早期診斷的生物學(xué)指標(biāo)也是目前臨床及基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。Hedgehog(Hh)信號通路已經(jīng)被證實(shí)在胚胎發(fā)育、器官穩(wěn)態(tài)維持等方面發(fā)揮重要作用[1]。近年來，通過對腫瘤治療靶點(diǎn)的深入研究，發(fā)現(xiàn)Hh信號通路對腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有顯著的促進(jìn)作用[2]，因此，推測Hh信號通路可能是調(diào)控癌癥發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制。目前關(guān)于Hh信號通路與前列腺癌病情及預(yù)后關(guān)聯(lián)的研究開展較少，因此本研究通過檢測前列腺癌患者Hh信號通路Shh、Ptch和Gli1蛋白表達(dá)水平，分析其表達(dá)與前列腺疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系，為其臨床治療提供參考。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取本院2014年1月—2016年1月經(jīng)手術(shù)治療病理確診的前列腺癌患者90例，年齡51～83歲，均取前列腺癌組織及病灶周邊<3 cm癌旁正常組織。根據(jù)腫瘤標(biāo)本組織鏡下癌細(xì)胞及間質(zhì)的分化程度進(jìn)行Gleason評分[3]。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次確診并接受手術(shù)治療；②術(shù)前未經(jīng)內(nèi)分泌、放射治療等其他治療方式；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他原發(fā)惡性腫瘤；②不配合相關(guān)治療；③術(shù)中標(biāo)本污染。病例脫落標(biāo)準(zhǔn)：①拒絕隨訪；②隨訪期失聯(lián)；③隨訪期因其他因素導(dǎo)致死亡。

1.2 免疫組織化學(xué)測定Hh信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

前列腺癌樣本、癌旁正常組織樣本離體后，經(jīng)10%中性甲醛固定48 h，石蠟包埋并4 μm切片。切片脫蠟水化后高溫高壓熱修復(fù)，3%雙氧水室溫封閉10 min，與Shh、Ptch和Gli1一抗孵育過夜后，二抗孵育30 min，PBS沖洗3次，每次2 min，DAB顯色。其后蒸餾水沖洗并蘇木精染色，用PBS代替一抗作為陰性對照。Shh、Ptch和Gli1蛋白在前列腺癌細(xì)胞的陽性表達(dá)均位于胞核、胞質(zhì)，根據(jù)染色細(xì)胞百分率、染色強(qiáng)度對結(jié)果進(jìn)行判讀。染色細(xì)胞百分率：著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞≤10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～100%為3分。染色強(qiáng)度：淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。上述兩種得分的乘積為每張切片著色程度得分，≤1分為陰性(-)、2～3分為弱陽性(+)、4～6分為陽性(++)、>6分為強(qiáng)陽性(+++)，弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性統(tǒng)稱為陽性。

1.3 生存時間的觀察

以術(shù)后次日作為隨訪起點(diǎn)，2020年1月1日或該時間點(diǎn)前患者死亡的時間點(diǎn)作為隨訪終點(diǎn)，采用門診復(fù)診、電話等方面進(jìn)行隨訪，以血清前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)、影像學(xué)檢查等方法明確復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間間隔作為無進(jìn)展生存時間或者總生存時間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；生存結(jié)局影響因素的分析采用Cox回歸模型；生存時間比較采用Kaplan-Meier生存分析。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌組織、癌旁正常組織中Hh信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較

前列腺癌組織中Hh信號通路相關(guān)蛋白Shh、Ptch和Gli1的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織(圖1)，說明前列腺癌伴隨著Hh通路相關(guān)蛋白高表達(dá)。

圖1 前列腺癌組織Hh信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)(免疫組化，400×)

2.2 Hh信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)與前列腺癌病理特征的相關(guān)性

不同Shh、Ptch和Gli1蛋白表達(dá)的前列腺癌患者臨床TNM分期、Gleason評分、合并骨轉(zhuǎn)移的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05；表1)。

表1 Hh信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)與前列腺癌病理特征的相關(guān)性 單位：例(%)

2.3 前列腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素的Cox分析

多因素Cox回歸分析顯示：臨床TNM分期Ⅲ、Ⅳ期、Gleason評分>7分、合并骨轉(zhuǎn)移、Shh蛋白表達(dá)陽性、Ptch蛋白表達(dá)陽性、Gli1蛋白表達(dá)陽性分別是前列腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05；表2)。

表2 前列腺癌無進(jìn)展生存期影響因素的Cox分析

2.4 Hh信號通路蛋白表達(dá)與前列腺癌患者無進(jìn)展生存期的關(guān)系

根據(jù)前列腺癌組織中Shh、Ptch和Gli1表達(dá)情況，將患者按3種蛋白分別分為陰性組及陽性組。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示，蛋白陰性組患者的無進(jìn)展生存時間均顯著長于蛋白陽性組(圖2；P<0.05)，提示Hh信號通路蛋白(Shh、Ptch和Gli1)表達(dá)與患者無進(jìn)展生存期呈負(fù)相關(guān)。

圖2 不同Shh、Ptch和Gli1蛋白表達(dá)的前列腺癌患者無進(jìn)展生存期的Kaplan-Meier曲線

3 討 論

前列腺癌是男性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。前列腺癌經(jīng)手術(shù)治療的療效較為理想，患者的5年生存率較高，但術(shù)后早期的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者總生存率下降的直接原因。因此，探索前列腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)前列腺癌早期診斷的生物學(xué)指標(biāo)，對改善前列腺癌患者的預(yù)后具有重要意義。Hh信號通路是一種進(jìn)化保守的通路，在脊椎動物和無脊椎動物的胚胎發(fā)育中起到重要作用，能夠調(diào)控傷口及組織愈合、維持細(xì)胞干性[4]。經(jīng)典的Hh信號通路由Hh配體、2個跨膜受體(Ptch、Smo)、下游核轉(zhuǎn)錄因子Gli及一些中間傳遞分子組成；當(dāng)Hh信號通路分子存在時,Ptch與Smo組成的受體復(fù)合物的空間構(gòu)象發(fā)生改變,Ptch對Smo的抑制作用被解除后,Smo向細(xì)胞內(nèi)呈遞信號,并將信號呈遞給轉(zhuǎn)錄因子Gli，激活后的轉(zhuǎn)錄因子Gli進(jìn)入細(xì)胞核能夠促進(jìn)目的基因的表達(dá)[5]。

通常情況下，Hh信號通路的活性較低[6]；在腫瘤細(xì)胞中，Hh信號通路參與了多種腫瘤在不同階段的發(fā)生發(fā)展過程。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Hh通路激活時，可通過表達(dá)Shh、Ptch、Smo和Gli等多重組分，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)腫瘤發(fā)展[7]。Li等[8]的研究指出Hh信號通路可調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)特性；Nitzki等[9]發(fā)現(xiàn)在橫紋肌肉瘤中存在Ptch的過表達(dá)；Dong等[10]則認(rèn)為Gli1的激活是埃洛替尼耐藥在人非小細(xì)胞肺癌中的關(guān)鍵機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，在人前列腺癌細(xì)胞中，Hh信號處于高度活躍狀態(tài)[11]。Hh在前列腺癌中的異常激活，說明其通路相關(guān)蛋白或與前列腺癌發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。

本文通過對前列腺癌組織樣本進(jìn)行分析，探究Hh信號通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)和前列腺癌發(fā)病及預(yù)后的關(guān)系，驗(yàn)證Hh相關(guān)蛋白是否能作為前列腺癌腫瘤標(biāo)志物，從而幫助疾病的診斷和治療。本文研究發(fā)現(xiàn)，Hh信號通路相關(guān)蛋白(Shh、Ptch和Gli1)過表達(dá)與前列腺癌疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，經(jīng)Kaplan-Meier生存分析，Hh信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)較高的前列腺癌患者無進(jìn)展生存時間短，本文研究結(jié)果證明Hh信號通路激活對前列腺癌患者具有不良影響，為后續(xù)前列腺癌的靶向治療提供新思路。Hh信號傳遞是通過靶細(xì)胞膜上的受體Ptch及Smo作用于核轉(zhuǎn)錄因子Gli1,從而引起靶基因的表達(dá),發(fā)揮其生理作用。Hh激活不僅能作為前列腺癌預(yù)后不良指標(biāo)，也是疾病的潛在治療靶點(diǎn)。目前，Hh信號通路抑制劑，如vismodegib和sonidegib，已被開發(fā)用于癌癥治療，特別是對難治性/晚期癌癥患者[12]。其中，Ross等[13]驗(yàn)證了sonidegib在前列腺癌中的療效；此外，Hh信號通路抑制劑聯(lián)合化療或放療手段，也能有效提高前列腺腫瘤的體內(nèi)外治療效果[14]。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了Hh信號通路激活及其相關(guān)蛋白高表達(dá)與前列腺癌患者不良預(yù)后緊密相關(guān)，Shh、Ptch和Gli1的表達(dá)能反應(yīng)疾病的嚴(yán)重程度，從而作為前列腺癌患者不良預(yù)后的生物指標(biāo)。