基于“脾主肌肉”理論探討Sirt1/Foxa1 通路介導澤明紅山顆粒治療非酒精性脂肪性肝炎的機制

任柏樾 姚輝 盧秉久 （遼寧中醫藥大學 研究生院,遼寧 沈陽 003; 附屬醫院傳染科）

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是一種受多因素影響的代謝應激性肝病。在祖國醫學中屬“痞滿”“鼓脹”等范疇，飲食不結，過食肥甘厚膩，脾失健運，痰濕蘊結，內生熱毒，互結于肝，以致肝失疏泄、木郁壅土，為本病的主要病機，疏肝健脾，清熱化濕，祛痰化瘀，滋補肝腎為本病的基本治則〔1〕。目前尚無有關NASH 特異性藥物，仍以預防危險因素為主，中醫藥在治療NASH 方面比較廣泛，主要體現在疏肝調脂，健脾祛濕，抑制氧化應激及肝臟纖維化等多個方面，盧秉久教授行醫三十余年，善用自擬的澤明紅山茶（澤瀉20 g、山楂20 g、決明子20 g、紅曲6 g、陳皮10 g、蒼術15 g）治療脂肪代謝紊亂性疾病〔2〕。本研究在澤明紅山茶上予以加減，創新藥物炮制方法，自擬澤明紅山顆粒用于NASH 臨床治療，效果顯著，但其作用機制尚不明確。

目前“二次打擊”被認為是NASH 的經典作用機制，所謂“初次打擊”是指NASH 初期肝功能異常導致脂質代謝紊亂及胰島素抵抗，機體糖原及脂肪酸異常蓄積，誘導肝細胞脂質變性。隨后的“二次打擊”即肝細胞的毒性作用，肝細胞經歷初次打擊后，對氧化應激、炎性介質、線粒體障礙等敏感性增強，進一步誘導肝細胞損傷〔3，4〕。《金匱要略》云:“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”，明確提出肝主疏泄功能與脾主運化之間互相作用機制，這與NASH“二次打擊”學說中胰島素抵抗與線粒體之間作用機制相對應〔3，5〕。本研究提出假說澤明紅山顆粒對NASH 的作用機制可能是通過調控胰島素-線粒體功能來實現的。

轉錄沉默信息調節因子（Sirt）1 是NAD+依賴的組蛋白脫乙酰酶，是細胞代謝的調節因子之一，Sirt1可以通過調節線粒體的生物發生、葡萄糖和脂質的穩態來控制代謝〔6～8〕。是Foxo1 轉錄功能的重要調節子，Sirt1 可通過去乙酸化作用調節Foxo1，促進其表達，而Foxo1 能夠通過降低氧自由基抑制骨骼肌損傷〔9，10〕。因此，Sirt1 去乙酸化介導的Foxo1 活性改變可能是一種通過調節脂質代謝來對抗NASH 的新機制或藥物靶點。本研究旨在基于脾主肌肉理論探討Sirt1/Foxa1 通路介導澤明紅山顆粒治療NASH的調控機制，為臨床防治NASH 提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF 級C57BL/6 小鼠40只，體重20～25 g，購自遼寧長生生物科技股份有限公司〔生產許可證SCXK（遼）2018-0001〕，飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心屏障系統（使用許可證SYXK 遼2013-0009），自由取食水。隨機分為對照組（control 組，n=10）、NASH 模型組（NASH 組，n=10）、NASH 模型+澤明紅山顆粒組（ZMHS 組，n=10）及多烯磷脂酰膽堿膠囊（易善復，購自賽諾菲制藥有限公司，批號H20059010）西藥對照組（PPC 組，n=10）。

1.2 NASH 模型制備 采用高脂純化飼養（MD45%添加0.5%膽固醇）法建立NASH 小鼠模型，control 組給予普通飼料，造模組予以高脂純化飼料，二者均購于江蘇美迪森公司。第4 周末開始，每周末于模型組中隨機抽取1 只小鼠，過量麻醉處死，打開腹腔，暴露肝臟，無菌條件下取肝臟做蘇木素-伊紅（HE）染色切片，直至第8 周末，隨機挑選3 只小鼠，行肝組織HE 染色，評價造模情況。ZMHS 組于模型成功后予以澤明紅山顆粒（由遼寧中醫藥大學附屬醫院提供）灌胃治療，PPC 組予以易善復治療，余組予以等量生理鹽水，連續干預4 w。PPC 組小鼠給藥劑量根據臨床成人單日用量最高劑量1.37 g/70 kg，按人與動物體質量系數進行換算后得到為0.18 g/kg；ZMHS 組給藥劑量根據成人臨床用量按人與動物體質量系數進行換算后得到（6.25 g/kg）。

1.3 樣品采集 各組于取材前12 h 禁食水，末次給藥后腹腔注射3.5%水合氯醛10 ml/kg 進行麻醉，于腹主動脈收集血液，3 500 r/min、5 min 分離血清，部分于全自動生化儀檢測，部分置于液氮中，剝離后腿腓腸肌組織及肝臟，部分置于多聚甲醛中固定，另一部分置于-80℃冰箱保存。

1.4 谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）水平檢測 利用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平。

1.5 HE 染色 取出固定后組織，PBS 沖洗殘留液體，經梯度酒精脫水，二甲苯透明，侵蠟包埋，組織切片機切片，厚度4～6 μm，水中燙平，貼片，烤片后，經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，于蘇木素染色5 min，1%鹽酸酒精分色5 s，氨水沖洗反藍1 min，蒸餾水沖洗30 s，經伊紅染液30 s，PBS 沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明處理，中性樹膠封片，光鏡下觀察組織形態結構。

1.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測 ELISA 試劑盒購自武漢優爾生生物科技有限公司，室溫下平衡試劑盒，取出酶標板，依次加入50 μl 標準品，設置對照組及樣品組，分別加入50 μl 樣品及蒸餾水，加入100 μl 酶標記溶液，37℃孵育1 h，充分洗板，各孔加入顯色劑A，B 液各50 μl，避光孵育15 min，加入50 μl 終止液，波長450 nm 的酶標儀上讀取各孔的吸光度（OD）值，OD 值為縱坐標（Y 軸），標準品的濃度為橫坐標（X 軸），繪制標準曲線圖。根據樣品的OD 值查找對應的濃度范圍。

1.7 腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）酶染色 新鮮肌肉組織冷凍切片，pH10.4 的工作液孵育5 min，傾去孵育液，pH9.4 的工作液孵育30 min，傾去孵育液，CaCl2 溶液處理3 次，每次2 min。硝酸鈷5 min，PBS 沖洗5 min。1% 硫化銨溶液30 s，PBS 沖洗5 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.8 免疫熒光 切片經脫蠟，水化后，固定10 min，PBS 沖洗3×3 min，加入血清封閉30 min，PBS 沖洗3×3 min，加入一抗，4℃孵育過夜，PBS 沖洗5×5 min，加入二抗，孵育2 h，DAPI 復染，封片，鏡下觀察。

1.9 Western 印跡 將組織剪碎，加入蛋白酶抑制劑的RIPA（Thermo，89900），勻漿，4℃下12 000 r/min離心5 min，分離上清液，BCA（Thermo，23225）蛋白定量試劑盒進行蛋白液濃度測定，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后進行蛋白轉膜，加入Sirt1（ab156585）、Foxa1（ab218201）抗體；4℃孵育過夜，PBS 清洗聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育2 h后，使用電化學發光（ECL）試劑盒和凝膠成像系統對蛋白進行顯色，結果使用Image J 進行分析。

1.10 統計學分析 應用SPSS21.0 軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 各組外周血清中ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL水平 與control 組相比，NASH 組血清中ALT、AST、TC、TG、LDL 表達明顯升高，HDL 表達明顯降低（P＜0.05），與NASH 組比較，ZMHS 組及PPC 組小鼠ALT、AST、TC、TG、LDL 表達明顯下降，HDL 表達明顯升高（P＜0.05），與PPC 組比較，ZMHS 組差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平表達(,n=10)

表1 各組ALT、AST、TC、TG、HDL、LDL 水平表達(,n=10)

與control 組比較:1）P＜0.05；與NASH 組比較:2）P＜0.05；下表同

2.2 HE 染色觀察肝臟病理形態 如圖1 所示，control 組小鼠肝組織結構完整，肝小葉結構正常，中央靜脈壁薄，肝細胞呈索條狀，呈放射轉排列，細胞結構清晰，胞質均勻，核質比例正常。NASH 組小鼠肝組織可見肝小葉結構尚正常，可見重度肝細胞脂肪變性，以彌漫性大泡脂肪變為主；肝細胞體積增大，胞質疏松，邊界欠清，呈氣球樣變；可見程度不等的點狀或灶性細胞壞死，肝實質及匯管區單核細胞及淋巴細胞浸潤。ZMHS 組及PPC 組可見肝細胞組織形態、結構，與模型組比較明顯改善。

圖1 HE 染色觀察各組肝臟損傷(×200)

2.3 各組小鼠骨骼肌中ATP、磷酸肌酸激酶（CPK）、α-羥丁酸脫氫酶（HBD）、ALT、乳酸脫氫酶（LDH）水平 與control 組比較，NASH 組肌肉中CPK、α-HBD、ALT、LDH 表達明顯升高，ATP 表達明顯降低（P＜0.05），與NASH 組比較，ZMHS 組及PPC 組CPK、α-HBD、ALT、LDH 表達明顯下降，ATP表達明顯升高（P＜0.05），與PPC 組比較，ZMHS 組ATP、CPK、α-HBD、ALT、LDH 表達變化無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組ATP、CPK、-HBD、ALT、LDH、Sirt1、Foxa1 蛋白表達(,n=10)

表2 各組ATP、CPK、-HBD、ALT、LDH、Sirt1、Foxa1 蛋白表達(,n=10)

2.4 ATP 酶染色觀察骨骼肌損傷情況 Ⅰ型肌纖維為淺色，Ⅱ型肌纖維為深色。control 組可見骨骼肌纖維大小均勻，形態規則，排列成馬賽克狀，NASH組Ⅱ型纖維染色加深，骨骼肌纖維增粗，出現明顯損傷，PPC 組骨骼肌纖維大小明顯恢復，形態較為規則，ZMHS 組可見Ⅰ型肌纖維及Ⅱ型肌纖維分布均勻，形態規則，肌纖維損傷基本恢復。見圖2。

圖2 ATP 酶染色觀察各組消失骨骼肌損傷(×200)

2.5 免疫熒光觀察過氧化物酶體增殖物活化受體激活因子（PGC-1）、過氧化物酶體增殖激活受體γ（PPARα）、核呼吸因子（NRF）-1、線粒體轉錄因子（mtTF）A 表達 與control 組比較，NASH 組血清中PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 表達明顯降低（P＜0.05），與NASH 組比較，ZMHS 組及PPC 組PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 表達明顯升高（P＜0.05），與PPC 組比較，ZMHS 組PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA表達變化無明顯差異（P＞0.05）。見圖3～6、表3。

圖3 免疫熒光觀察各組PGC-1 表達(×200)

圖4 免疫熒光觀察各組PPARα 表達(×200)

圖5 免疫熒光觀察各組NRF-1 表達(×200)

圖6 免疫熒光觀察各組mtTFA 表達(×200)

2.6 Western 印跡檢測Sirt1、Foxa1 蛋白表達 與control 組比較，NASH 組血清中Foxa1 蛋白表達明顯升高，Sirt1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），與NASH 組比較，ZMHS 組及PPC 組Foxa1 蛋白表達明顯降低，Sirt1 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），與PPC組比較，ZMHS 組Sirt1、Foxa1 蛋白表達變化無明顯差異（P＞0.05）。見表3、圖7。

表3 各組PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 蛋白陽性表達(,n=10)

表3 各組PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 蛋白陽性表達(,n=10)

圖7 Western 印跡檢測Sirt1、Foxa1 蛋白表達

3 討論

目前已知脂肪蓄積、胰島素抵抗誘導炎性反應及氧化應激反應與肝功能異常的相互作用是引起NASH 病理進展的主要原因。因此及時把握NASH病理變化進展對于治療NASH 具有重要意義〔11，12〕。中醫學中將NASH 稱“肝癖”，其病位在肝，脾，腎，主要與氣、血、津液的生成及運行相關，氣滯，血瘀，痰濕為其主要病理產物。肝癖早期，因飲食不結、情志不調、素體肥胖等因素導致肝失疏泄，氣機郁滯，內生痰濕，脾失健運，進一步影響氣機通暢，早期則以脾虛肝郁為主，兩者相互影響，蘊生痰濕，血瘀等病理產物〔13〕。這與NASH 早期胰島素抵抗，脂質代謝紊亂機理相一致。而病程日久，氣血生化乏源，先天無以養后天，后期累積于腎，導致腎精虧虛，肝腎功能異常，進一步接受病理產物損傷，則是NASH 二次打擊的病理體現，因此疏肝健脾，活血利水是治療NASH 早期病理性損傷的主要治則〔14〕。澤明紅山顆粒主要由澤瀉、山楂、決明子、紅曲四味藥組成，山楂、紅曲兩者在肝癖早期共行健脾祛濕，活血化瘀之功效，此外現代醫學研究表明，紅曲米中有效成分具有降脂、抑炎、保護肝細胞等作用，同時還具有調節血糖代謝，抑制胰島素抵抗的作用〔15～17〕。澤瀉、決明子具有利水祛濕，清肝瀉火的功效，同時有研究發現澤瀉可以抑制內源性膽固醇合成的作用。上述四味藥共奏益氣健脾，活血化瘀，利水祛濕的作用，本研究發現澤明紅山顆粒可以顯著抑制NASH 小鼠外周血清中膽固醇表達，同時改善小鼠肝臟病理損傷，說明澤明紅山顆粒對調節NASH 脂質代謝紊亂及胰島素抵抗具有重要作用。

胰島素抵抗被認為是NASH 早期病變的核心及啟動因素，大量游離脂肪酸蓄積，促進胰島素抵抗的發生，導致葡萄糖不能對組織細胞攝取及利用，誘導線粒體氧化應激反應發生，ATP 合成減少，是引起靶器官損傷的主要原因〔18〕。骨骼肌細胞是能量代謝的主要部位，在機體能量代謝和維持葡萄糖穩態環境中發揮重要作用，是NASH 主要受損靶器官之一，有研究發現骨骼肌細胞線粒體功能障礙，導致ATP合成/釋放異常，胰島素抵抗發生的潛在重要因素，因此改善骨骼肌細胞損傷有助于提高胰島素抵抗的敏感性〔19〕。從中醫角度血糖、脂肪、蛋白質等就是“精微物質”，水谷精微的轉化，依賴于脾主運化功能正常，脾失健運，水谷精微物質堆積在體內，又依賴于胰島素的調節，當胰島素抵抗發生時，蓄積在血脈中的精微物質不能被組織有效吸收利用，同時又加重脾的運化功能〔20〕。因此本研究認為脾主運化與胰島素的調節作用關系密切。本研究發現澤明紅山顆粒可以顯著改善NASH 小鼠骨骼肌損傷，同時促進ATP 的合成，抑制肝臟膽固醇的合成及骨骼肌細胞中的脂質堆積，提示“脾主肌肉”理論下，健脾對于調節骨骼肌胰島素抵抗，促進線粒體功能恢復，改善肝功能損傷具有重要意義。

PGC1-α 是細胞內重要的核轉錄輔助因子，能夠促進骨骼肌細胞線粒體的增殖及氧化過程，并刺激線粒體氧化合成ATP，其主要由PPAR 激活，增加脂肪酸氧化酶β 的活性，參與調節脂肪酸氧化及合成平衡〔21〕。NRFs 是由核基因編碼的，主要作用于線粒體的呼吸鏈蛋白，主要與線粒體呼吸及編碼線粒體酶有關，有研究發現NRFs 可以促使mtTFA 的表，促進線粒體的活性，提高胰島素的活性，以促進脂質代謝及葡萄糖代謝過程，共同維持細胞能量代謝穩態，而PGC1-α 是調控NRFs 及mtTFA 的上游，其活性是反映機體線粒體功能及胰島素的重要因素〔22〕。本研究發現澤明紅山顆粒可以顯著抑制NASH 小鼠骨骼肌中PGC-1、PPARα、NRF-1、mtTFA 表達，進一步說明澤明紅山顆粒可以提高游離脂肪酸的利用度，減輕肝臟負擔，增加胰島素的敏感性，從而改善NASH 小鼠的肝臟及肌肉組織損傷。

Sirt1 是屬于Sirtuins 家族的一種組蛋白去乙酰化酶，主要參與調節多種重要的生物學功能，如氧化應激、能量代謝、凋亡和自噬〔23〕。此外，Sirt1 通過去乙酰化調控下游蛋白Foxa1 去乙酰化，參與調控氧化應激的蛋白的表達。PGC-1α 在骨骼肌組織中高度聚集，參與調節下游和線粒體氧化應激相關蛋白的表達，AMPK 可以調節Sirt1 的活性，增加細胞內NAD+，從而激活NAD+依賴的Sirt1 發揮生物學效應〔24〕。激活的AMPK 和Sirt1 調節PGC-1α 的活性，在線粒體生物合成、能量代謝中起著重要的調節作用〔25〕。本研究發現澤明紅山顆粒可以顯著上調NASH 小鼠骨骼肌中Sirt1 表達，下調Foxa1 表達，這一調控機制進一步提示澤明紅山顆粒能夠通過調控Sirt1/Foxa1 通路，促進NASH 小鼠骨骼肌細胞線粒體合成，提高骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取及利用，促進游離脂肪酸的糖異生，降低肝細胞的負荷，增加胰島素敏感性，從而起到保護NASH 小鼠肝臟及骨骼肌組織免于胰島素抵抗及脂質代謝異常等造成的應激性損傷。