PD-L1在幽門螺桿菌胃炎不同階段的表達及意義

羅粟風 張 丹 呂俊衍 文 玉 施春晶 普光宇 姜 鑫 馬嵐青

幽門螺桿菌(Hp)感染在胃黏膜萎縮和腸化生的發生、發展中起著重要作用，約1%的Hp胃炎可進展為胃癌[1]。近年來的研究表明，在炎性反應致癌通路中，腫瘤微環境中產生的促炎細胞因子可通過穩定程序化細胞死亡配體-1(PD-L1)的表達進而抑制T細胞監視腫瘤細胞的免疫功能，最終導致抗腫瘤免疫力的逐步削弱，使得腫瘤細胞存活率升高[2]。目前PD-L1表達在Hp胃炎進展中的變化尚未明確。本研究通過檢測PD-L1在Hp胃炎進展的不同階段中的表達情況，旨在探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料

選擇2019年4月至2020年1月在昆明醫科大學第一附屬醫院接受胃鏡檢查的12例患者(排除有免疫系統疾病、膽汁反流性胃炎、凝血功能障礙的患者，肺癌、腎細胞癌、黑色素瘤等惡性腫瘤患者，以及有消化道腫瘤及相關治療史、胃大部切除術后、近期有影響Hp檢測結果的藥物治療史的患者)，其中男性9例、女性3例，年齡21～61歲，平均年齡為(38.9±11.6)歲。依據《胃炎京都分類》[3]及《中國慢性胃炎共識意見(2017年,上海)》[4]，所有患者均在胃竇部取活體組織送病理檢查，并行14C尿素呼氣試驗。將《中國慢性胃炎共識意見(2017年,上海)》[4]作為病理分組標準，依據活體組織病理檢查、Hp特殊染色法及14C尿素呼氣試驗的結果，將患者分為Hp陰性非萎縮性胃炎組即正常組(A組)、Hp陽性非萎縮性胃炎組(B組)、Hp陽性萎縮性胃炎組(C組)、Hp陽性萎縮性胃炎伴腸化生組(D組)，每組3例。所有患者均留取2份胃黏膜活體組織，其中一份分別行H-E染色和Hp特殊染色，另一份則用液氮保存以備PD-L1蛋白表達情況的檢測。病理診斷由兩位病理科主任醫師完成。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 H-E染色試劑購于丹麥DAKO公司；胃黏膜組織及Hp雙重染色液(Hp特殊染色試劑)購于泰普生物科學有限公司；兔抗人單克隆抗體(抗PD-L1一抗)購于美國Abcam公司；羊抗兔單克隆抗體二抗購于丹麥DAKO公司；抗GAPDH一抗購于塞維爾公司；SpectraMax 190型全波長酶標儀購于美國MD公司；BIO-RAD MiniPROTEAN Tetra電泳儀、Trans-Blot半干轉膜儀及Chemical XRS+顯影系統均購于美國BIO-RAD公司。

1.2.2Hp檢測 根據14C尿素呼氣試驗檢測Hp感染，>100為Hp陽性，0為Hp陰性(0～100不納入研究)。石蠟包埋胃竇黏膜組織，切成3～5 μm薄片行Hp特殊染色，在顯微鏡下(×400)觀察，可見胃小凹或隱窩內有魚簇狀的彎曲短桿形、逗號形、S形或C形的紫藍色細菌為Hp陽性，未見到為陰性。最終判定標準：兩種檢查均陽性為Hp陽性；均陰性為Hp陰性；若14C尿素呼氣試驗結果為陽性而Hp特殊染色結果為陰性則排除該病例，反之則納入為Hp陽性(無此情況)。

1.2.3 Western Blotting檢測 采用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質，轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉。隨后在含有5%脫脂奶的TBST中與一抗過夜孵育，二抗孵育1 h，最后將膜洗滌后用ECL試劑進行顯影，對條帶強度進行PD-L1定量分析。

1.2.4 免疫組織化學染色檢測 石蠟包埋胃竇部黏膜組織，切片，65 ℃烤片30 min，經二甲苯脫蠟2次，依次置于90%、80%、70%乙醇及ddH2O各5 min。將玻片放入含EDTA緩沖液(pH=8.0)的高壓鍋中煮沸，開蓋自然冷卻至室溫。采用ddH2O漂洗、3%雙氧水溶液室溫下浸泡15 min。隨后置于PBS緩沖液(pH=7.2)中浸泡3次，每次5 min。加入一抗(1∶250)，4 ℃下C盒內過夜。PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min。加入二抗，室溫下孵育40 min。PBS緩沖液中浸泡3次，每次5 min。DAB顯色系統顯色，顯微鏡下控制顯色時間。采用ddH2O漂洗，蘇木精襯染，自來水沖洗玻片，無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，65 ℃烘干封片，置于顯微鏡下(×400)觀察有無細胞質或細胞膜染色呈棕黃色的PD-L1陽性表達細胞。

1.3 統計學方法

研究資料采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。均數多組間比較采用單因素方差分析，組間差異的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組內鏡下表現及經不同染色法的胃黏膜活體組織病理圖比較

A組內鏡下可見胃竇部黏膜紅白相間，以紅為主，整個胃黏膜平滑、有光澤，無隆起、糜爛等病變；活體組織取材后，經H-E染色，顯微鏡下可見胃黏膜呈非活動性非萎縮性胃炎表現，伴少量炎性細胞浸潤。B組內鏡下可見胃竇部黏膜紅白相間，以紅為主，黏膜多處可見隆起型糜爛、凹陷型糜爛伴陳舊性出血斑附著，黏膜呈水腫樣改變；活體組織取材后，經H-E染色，顯微鏡下可見大量炎性細胞浸潤，未見胃固有腺體出現明顯萎縮或腸化生細胞。C組內鏡下可見胃竇部黏膜以白為主伴明顯斑狀發紅，黏膜血管隱約透見，黏膜粗糙不光滑；活體組織取材后，經H-E染色，顯微鏡下可見大量炎性細胞浸潤(與B組相似)，胃黏膜固有腺體數量較少，未見腸化生細胞。D組內鏡下可見胃竇部黏膜有多發性灰白色扁平隆起；活體組織取材后，經H-E染色，顯微鏡下可見大量炎性細胞浸潤，胃黏膜固有腺體數量較少，有空杯狀腸化生細胞。經Hp特殊染色，B、C、D組在顯微鏡下于胃小凹或隱窩內均可見呈魚簇狀的彎曲短桿形、逗號形、S形或C形的紫藍色細菌，而A組未見此細菌。見圖1。

注：黑色箭頭表示內鏡下Hp感染胃黏膜征象；紅色三角表示浸潤的免疫細胞；紅色箭頭表示腸化生細胞；黃色箭頭表示Hp菌體

2.2 各組胃黏膜活體組織中PD-L1蛋白表達水平的Western blotting法檢測結果

Western blotting法檢測結果顯示，B組、C組、D組的胃黏膜活體組織中PD-L1蛋白表達水平均明顯高于A組，差異均有統計學意義(P均<0.000 1)；C組的PD-L1蛋白表達水平明顯高于B組，差異有統計學意義(P<0.01)；D組與C組的PD-L1蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.3 各組胃黏膜活體組織中PD-L1表達水平的免疫組織化學染色結果

PD-L1陽性表達表現為細胞質或細胞膜上呈棕黃色。顯微鏡下，免疫組織化學染色結果顯示，A組未見明顯的PD-L1陽性表達細胞，B、C、D組均可見明顯的PD-L1陽性表達細胞。見圖3。

注：與A組比較，****P<0.000 1；B組與C組比較，**P<0.01；C組與D組比較，ns為P>0.05

注：黑色箭頭指向棕黃色染色細胞，為PD-L1陽性表達細胞

3 討論

中國的Hp感染率較高，研究報道Hp感染率為40%～60%[5]。多數Hp感染者并無明顯癥狀和并發癥發生，但幾乎所有患者均存在慢性活動性胃炎，即Hp胃炎[6-7]。Hp感染是導致胃癌發生的環境因素中較為重要的因素，WHO早在1994年即已將Hp列為人類胃癌Ⅰ類致癌原[8]。胃癌是全球第3位常見致死性惡性腫瘤[9]，中國是胃癌高發國家，近年來研究報道中國胃癌的年發病率為29/10萬(GLOBOCAN2018)[10]。根據Correa[1]提出的胃癌發生模型，腸型胃癌(占胃癌多數)的發生模式為正常胃黏膜→淺表性胃炎→萎縮性胃炎→腸化生→異型增生→胃癌，已獲公認。由此可見，Hp胃炎是進展為胃癌過程中的一個重要階段。

程序化細胞死亡受體-1(PD-1)/ PD-L1是免疫球蛋白B7-H家族中的免疫信號分子，屬于抑制性信號分子，兩者結合在生理條件下，機體對抗病原體的免疫反應過程中，對于建立外周耐受和避免自身免疫性反應發生或防止對組織的過度損傷至關重要[11]。當其異常表達于各種腫瘤細胞和(或)免疫細胞時，與促炎性細胞因子共同構成腫瘤微環境成分，參與調控T細胞功能，逃避免疫監視[12]。而針對免疫監視抑制點的PD-1/PD-L1抑制劑已成功用于多種惡性腫瘤的治療中(如非小細胞肺癌、黑色素瘤、晚期胃癌等)[13-16]。研究表明Hp感染可刺激胃癌組織中PD-L1的表達[17-18]，Hp可誘導正常胃黏膜中PD-L1的高表達[19-23]。然而，目前鮮有研究關注PD-L1在Hp參與慢性胃炎進展至胃癌這一復雜過程中所扮演的角色，特別是發生萎縮性胃炎前和早期胃癌。而Hp胃炎是進展為胃癌過程中的一個重要階段，探討PD-L1在此進程中的表達情況具有重要意義。

Guo等[24]用免疫組織化學方法檢測了慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃低級別上皮內瘤變、胃高級別上皮內瘤變、胃腺癌標本(Hp感染情況不詳)中的PD-L1表達水平，結果顯示PD-L1表達水平在腸型胃癌發生、發展過程中的差異無統計學意義。Shen等[25]采用流式細胞術和免疫熒光技術分析PD-L1的表達水平，結果顯示PD-L1在胃高級別上皮內瘤變和早期胃癌組織中的表達水平明顯高于胃低級別上皮內瘤變組織(無論Hp陽性或陰性)。本研究采用免疫組織化學法和Western blotting法檢測了PD-L1在正常胃黏膜、非萎縮性胃炎、萎縮性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化生組織中的表達情況，結果表明Hp感染可顯著升高胃黏膜中PD-L1的表達水平，且PD-L1的表達隨著Hp胃炎的進展呈逐漸升高趨勢，提示PD-L1極有可能參與了慢性胃炎進展至胃癌的過程，提示防控胃癌應及早采用根除Hp治療，且需在Hp胃炎進展為萎縮性胃炎及發生腸化生前甚至更早期采取積極的干預措施。

值得注意的是，本研究觀察到，當感染Hp時，D組(萎縮伴腸化生組)中上調的PD-L1表達水平與C組(萎縮組)相比，差異無統計學意義(P>0.05)，推測可能的原因為：Hp多定植于胃黏膜表面和胃黏液底層，隨著萎縮性胃炎的病情加重，胃黏膜腺腔逐漸減少及腸化生細胞逐漸增多，將不利于Hp定植密度的升高，Hp誘導PD-L1表達水平升高的作用也因此受到影響。目前其具體機制尚不清楚，有待今后進一步研究。

綜上所述，本研究觀察到Hp胃炎不同階段的胃黏膜中PD-L1表達水平不同，Hp感染可刺激PD-L1的表達上調，并且隨著胃黏膜病變的進展，PD-L1表達水平呈升高趨勢。因此，積極行根除Hp治療，早期控制Hp胃炎向萎縮性胃炎伴腸化生發展在早期胃癌防控中具有重要的意義。本研究尚存在不足之處，為單中心研究且樣本量偏少，可能造成研究結果發生偏倚，今后還需進行大樣本、多中心研究來驗證。未來可進一步收集經Hp根除治療后的胃黏膜作為對照組，探討PD-L1表達的變化，以期為Hp根除治療提供新的理論依據。