環境脅迫對清香型白酒發酵核心微生物生長的影響

楊 埔，蔚慧欣，張 鑫，王鵬然，甄 攀，張麗珍2，，韓 英

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西汾陽 032209；2.山西大學杏花村學院（山西釀造產業研究院（籌）），山西太原 030006；3.山西大學生命科學學院，山西太原 030006）

清香型白酒是中國白酒三大基本香型之一，其產品風格突出“清香、柔和、勁爽、舒適”的特點[1]。傳統清香型白酒的發酵過程包括2 個階段，即大米查發酵和二米查發酵。一般來說，在清香型白酒的發酵過程中，酒醅理化性質會隨著發酵時間的變化而變化。酒醅溫度呈現先升高，后降低的趨勢。起始溫度為10～20 ℃，頂火溫度可以達到30 ℃以上，最終保持在22～25 ℃，直到發酵完成[2-3]。在整個發酵階段，酒醅酸度持續升高[3]，pH 值呈現下降的趨勢[2]。而乙醇產量在7～14 d達到最高，此后保持基本穩定[2-3]。

釀酒過程本質上就是微生物的代謝過程。一般來說，霉菌在發酵之初起到糖化作用，其代謝產生的寡糖或單糖可以被酵母菌直接利用產生酒精。而細菌主要產生白酒風味物質及其前體物質（如有機酸），起增香提味的作用[4-5]。利用高通量測序技術對清香型白酒釀酒過程中微生物群落結構的研究表明，酒醅中真菌和細菌群落組成復雜，并且隨著發酵過程而變化。其中，酵母屬和復膜孢酵母屬是優勢真菌，而乳桿菌屬、片球菌屬是優勢細菌[5]。

微生物的生長代謝受到多種環境條件的影響，如溫度、氧氣、pH 值。在清香型白酒發酵的中后期，隨著乙醇和有機酸（如乙酸、乳酸）含量的上升，這些環境脅迫不可避免的會對釀酒微生物的生長代謝造成影響。雖然通過高通量測序技術可以獲得酒醅發酵微生物的演替規律，但是卻無法闡明微生物演替的機制。鑒于此，本項目將以分離自酒醅的核心純種微生物為研究對象，分析環境脅迫（乙醇、乙酸、乳酸）對這些微生物生長的影響。本研究有助于闡明白酒發酵過程中微生物演替的規律，并可以為白酒發酵工藝的改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母和產酸菌由本實驗室分離自汾陽市某酒廠并保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 培養基與試劑

MRS 培養基購自北京索萊寶科技有限公司，調整pH5.5后，115 ℃滅菌30 min。

YPD 培養基：酵母粉10 g，葡萄糖20 g，麥芽糖20 g，蛋白胨20 g，水1 L，pH 5.5。固體培養基中加入15 g/L瓊脂。115 ℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 環境脅迫對酵母菌生長的影響

采用固體平板法分析酵母菌對環境脅迫的耐受性。在YPD 固體培養基中分別加入不同濃度的乳酸（0.5%v/v、1%v/v、2%v/v、4%v/v 和8%v/v）、乙酸（0.125 %v/v、0.25 %v/v、0.5 %v/v、1 %v/v 和2 %v/v）或乙醇（4 %v/v、8% v/v、12 %v/v、16 %v/v和20%v/v）后傾倒平板，再用滅菌槍頭分別挑取純種酵母菌的單菌落，接種于上述固體培養基，30 ℃培養72 h后觀察菌株是否生長。

1.2.2 環境脅迫對產酸菌生長的影響

采用固體平板法分析產酸菌對環境脅迫的耐受性。在pH5.5 的MRS 固體培養基中分別加入不同濃度的乳酸（0.125 %v/v、0.25 %v/v、0.5 %v/v、1 %v/v、2 %v/v 和4 %v/v）、乙酸（0.125 %v/v、0.25%v/v、0.5%v/v、1%v/v、2%v/v 和4%v/v）或乙醇（4 %v/v、8 %v/v、12 %v/v、16 %v/v 和20 %v/v）。然后用滅菌槍頭分別挑取純種產酸菌的單菌落，并將其接種于上述固體培養基，35 ℃培養120 h 后觀察菌株是否生長。

2 結果與分析

2.1 酵母菌對乳酸的耐受性

酵母菌對乳酸的耐受性結果如圖1 所示。所有的酵母菌都可以在含有2 %乳酸的YPD 培養基上生長。大部分酵母菌（62/64）對4 %乳酸具有耐受性；只有1 株酵母菌可以在含有8 %乳酸的培養基上生長，但是菌落較小。

圖1 釀酒酵母對乳酸的耐受性

2.2 酵母菌對乙酸的耐受性

酵母菌對乙酸的耐受性結果如圖2 所示。大部分酵母菌可以在含有0.125 %（64/64）、0.25 %（63/64）和0.5%（57/64）乙酸的培養基上生長。1株酵母菌可以在含有1 %乙酸的培養基上生長。所有的菌株都不能在含有2%乙酸的培養基上生長。

圖2 釀酒酵母對乙酸的耐受性

2.3 酵母菌對乙醇的耐受性

酵母菌對酒精的耐受性結果如圖3 所示。有61 株（95.3%）酵母菌可以耐受20%乙醇，另外3 株酵母菌只能耐受8%的乙醇。

圖3 釀酒酵母對乙醇的耐受性

2.4 產酸菌對乳酸的耐受性

產酸菌對乳酸的耐受性結果如圖4 所示。所有產酸菌都可以在不含乳酸的MRS 固體培養基上生長。隨著乳酸濃度的增加，產酸菌的耐受性逐漸降低。只有1 株產酸菌對0.125 %乳酸敏感，而只有6 株（11.3%）產酸菌可以在含有1%乳酸的培養基上生長，2 株菌可以耐受2%乳酸。4%乳酸能抑制所有產酸菌的生長。

圖4 產酸菌對乳酸的耐受性

2.5 產酸菌對乙酸的耐受性

產酸菌對乙酸的耐受性結果如圖5 所示。在陽性對照中，所有的產酸菌都可以生長，有46 株（86.8 %）產酸菌可以耐受0.125 %乙酸，34 株菌可以耐受0.5%乙酸；但是只有6 株（11.3%）產酸菌可以耐受1%乙酸，2 株（3.8%）菌可以耐受2%乙酸，所有菌株都不能在4%乙酸培養基上生長。

圖5 產酸菌對乙酸的耐受性

2.6 產酸菌對乙醇的耐受性

產酸菌對乙醇的耐受性結果如圖6 所示。只有6 株（11.3%）產酸菌對12%乙醇敏感，而有18 株（34.0%）產酸菌可以耐受20%乙醇。

圖6 產酸菌對乙醇的耐受性

3 討論

在白酒發酵過程中，微生物代謝活動產生了種類繁多的代謝產物。其中，釀酒酵母是最主要的酒精產生菌[6]，乳酸菌的主要功能是產生乳酸和乙酸[7]，而己酸菌，如梭菌屬、瘤胃菌科、巨球型菌屬、芽孢桿菌屬，則可以產生己酸[8]。隨后，畢赤酵母可以將有機酸和乙醇轉化為酯類[9]。這些物質構成了白酒中最主要的呈香物質。目前的研究也主要集中在這些風味物質的功能上。然而，當乙醇、有機酸等物質含量過高時，也會抑制微生物的生長。這些環境脅迫對釀酒核心微生物生長代謝的影響，尚無系統的研究與報道。

研究顯示，隨著培養基中乳酸濃度的升高，乳桿菌細胞分裂變慢，代時延長，細胞體積和長度均變小[10]。有機酸在未解離狀態下是脂溶性的，可以通過自由擴散透過微生物細胞膜進入胞內，從而對微生物細胞產生毒害[11]；而解離部分會造成胞內pH 值的變化，進而影響DNA 的合成等過程，最終影響細胞生長[12-13]。因此，有機酸可以被用于食品防腐[11]。在傳統白酒發酵的中期，酒醅中的乙酸含量可達0.1 %～0.15 %[14-15]，而乳酸含量為0.6 %～1 %[14，16]。在該條件下，所有的酵母菌和一部分產酸菌（0.125 %乙酸，45/53；1 %乳酸，6/53）可以生長。而在發酵第28 天，酒醅中乙酸、乳酸含量分別達到了0.3%～1.7%[14-15]和1.2%～1.9%[14，16]，此時的乙酸濃度會嚴重抑制所有酵母菌和大部分產酸菌的生長，而乳酸濃度會抑制產酸菌的生長，但是幾乎不會抑制酵母菌的生長。

乙醇不僅會影響微生物細胞膜組成、結構和流動性[17]，而且會導致DNA 復制速率的降低和DNA突變速率的增加[18]。在傳統白酒的發酵過程中，酒醅中乙醇的含量可達10%以上，而在控溫發酵中，乙醇含量可以達到20%[3]。本實驗的結果證實，大部分（61/64）酵母菌和一部分產酸菌（18/53）對高濃度（20%）乙醇表現出耐受性。

在傳統發酵過程中，前期是產酒精過程，酒醅中酒精含量在7～14 d 即達到最高。然而，此時環境中的乙醇和有機酸并不影響酵母菌的生長。因此，酒精生成的停滯可能是其他環境條件引起的。而后期是產酸產酯的過程，產酸菌的生長并未受到抑制，并且產酸過程也可以持續發生。因此，環境因素影響酵母菌酒精產量的原因和機制，將是下一步的研究重點。