基于Nrf2通路探討環黃芪醇調控H2O2致HT22細胞氧化應激損傷的作用

郝任娟，陸韻薇，于顧然

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）作為比較常見的神經退行性疾病之一，其基本病理特征主要表現為淀粉樣蛋白和Tau 蛋白沉積、神經元丟失以及突觸功能障礙［1］。抗氧化系統的失衡，即氧化應激作為引起AD 病理改變的基本機制之一，會導致AD 患者大腦中神經毒性蛋白的積累。由于大腦中含有相對于其他器官更少的抗氧化酶，故其神經元更易受到氧化損傷，進而導致疾病的惡化［2］。研究表明，核因子E2 相關因子2（Nuclear factor E2－related factor 2，Nrf2）在調節氧化還原穩態中起重要作用，Nrf2 信號的激活在體外和體內對AD相關模型均有改善作用。因此，Nrf2途徑可能成為篩選和開發對AD 具有預防或治療作用的新型抗氧化劑的潛在靶點［3］。

環黃芪醇（Cycloastragenol）為三萜皂苷類化合物，是黃芪甲苷在胃腸道代謝過程中水解的生物活性皂苷，而黃芪甲苷則是黃芪的活性成分［4］。研究顯示，黃芪具有抗菌、止汗、消炎、利尿和滋補的作用，現代藥理學研究則表明，黃芪對于D－gal 誘導的衰老小鼠模型具有顯著的抗衰老作用，黃芪處理可抑制氧化應激誘導因子MDA 的水平、增加抗氧化因子SOD 和GSH 活性［5-6］。此外，ADESSO 等［7］發現，黃芪可刺激H2O2誘導的體外腸上皮細胞氧化應激模型中Nrf2 的活化，增加Nrf2 相關保護因子HO－1 和NQO1 的表達。環黃芪醇作為黃芪活性成分的水解產物，現代藥理學研究顯示，其具有抗衰老、抗炎、抗氧化、抗凋亡、保護神經細胞、調節免疫等多種藥理作用［8］。體外實驗研究表明，環黃芪醇還可以通過減弱Aβ1－42誘導的內皮連接蛋白的下調，保護血腦屏障的通透性［9］。然而目前尚未發現有關環黃芪醇對神經元細胞氧化應激損傷保護作用的相關探討，基于此，本實驗通過H2O2處理小鼠海馬神經元細胞以構建體外氧化應激模型，評估環黃芪醇調控氧化應激損傷的作用。

1 材料與儀器

1.1 細胞

小鼠海馬神經元細胞（HT22 細胞，武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 試劑與藥品

環黃芪醇（純度>99%，成都曼斯特生物科技有限公司），配制為5 mmol/L 工作液于－20 ℃儲存；二甲基亞砜（DMSO）及MTT 工作液（Sigma 公司）；DCFH－DA活性氧探針（碧云天生物技術有限公司）；β－actin、Caspase－3、 Cleaved Caspase－3、 Bax、 Bcl－2、Cytochrome C、Nrf2 檢測試劑盒（Proteintech 公司）；鼠二抗、兔二抗（武漢賽維爾生物科技公司）。

1.3 儀器

CO2細胞培養箱（HERA cell 1501 型）；生物安全柜（1300A2 型）；酶標儀（ELX－800 型）；電泳儀及轉膜儀（北京六一生物科技有限公司）；伯樂凝膠系統成像儀（CHEMIDO C XRS +）；離心機（Heraeus Fresco21）；正置熒光顯微鏡（DS－Qi2型）。

2 方法

2.1 細胞培養

HT22 細胞采用添加青霉素－鏈霉素－兩性霉素B（100×）的DMEM 培養基（高糖，含10%胎牛血清）培養，所有細胞置于5%CO2，37 ℃的細胞培養箱中，待細胞生長至80%密度時進行傳代，每天更換培養基。

2.2 MTT 法檢測環黃芪醇對細胞活性的影響和保護作用

先通過對不同濃度環黃芪醇處理的HT22 細胞活性進行檢測，以篩選出較為合適的濃度用于后續實驗，采用環黃芪醇對HT22 細胞先進行預保護24 h，再于每組細胞中分別添加H2O2，觀察環黃芪醇對HT22 細胞氧化損傷的保護作用。方法：取對數生長周期的細胞，調整細胞密度為5 × 104/mL，均勻接種于96 孔板中，每孔100 μL，于5% CO2，37 ℃的細胞培養箱中培養24 h，之后分別加入100 μL 不同濃度的環黃芪醇繼續培養24 h。每孔加入20 μL MTT 溶液，于細胞培養箱中繼續培養4 h，之后棄去原有培養基，每孔加入150 μL DMSO，充分震蕩10 min，酶標儀490 nm 處檢測每孔的吸光度值（OD）。

細胞活性（%）=（實驗組OD 值－調零孔OD 值）/（空白組OD 值－調零孔OD 值）× 100%

2.3 DCFH－DA 活性氧熒光探針檢測ROS 水平

取對數生長期細胞，調整細胞密度為（15～25）×104/mL，均勻接種于12 孔板中，每孔1 mL，于5% CO2，37 ℃的細胞培養箱中培養24 h。第2 天棄去原培養基，將細胞分為5 組，其中空白組和H2O2組加入不含環黃芪醇的培養基，其余3 組分別加入含有不同濃度環黃芪醇（50、75、100 μmol/L）的培養基繼續培養24 h。之后除空白組外，其余4 組均加入H2O2繼續培養4 h 以造成細胞急性氧化應激。按試劑說明書配制DCFH－DA 活性氧探針工作液，12 孔板中棄去原有培養基，加入工作液37 ℃避光孵育30 min，吸去工作液，用PBS 洗3 遍后，正置熒光顯微鏡下觀察ROS 的產生情況。

2.4 免疫熒光染色檢測細胞入核情況

取對數生長期細胞，調整細胞密度為（10～20）×104/mL，均勻接種于12 孔板中，每孔1 mL，分組及后續給藥處理操作同上。用預冷的PBS 洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.3% TritonX－100 室溫孵育20 min，免疫熒光封閉液室溫封閉60 min，與一抗（Nrf2）4 ℃共同孵育過夜。37 ℃復溫后用PBST洗3遍，與相應種屬二抗室溫避光孵育1 h，復染DAPI 10 min，正置熒光顯微鏡下觀察Nrf2的入核情況。

2.5 蛋白免疫印跡檢測相關蛋白的表達量

取對數生長期細胞，調整細胞密度為（30～40）×104/mL，均勻接種于6 孔板中，每孔2 mL，于5% CO2，37 ℃的細胞培養箱中培養24 h，分組及后續給藥處理操作同上。棄去培養基，用預冷的PBS 洗3 遍，之后每孔加入60 μL RIPA 裂解液（含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、EDTA、PMSF）冰上裂解30 min，收集細胞超聲裂解15 s，每個樣品3次，4 ℃，12 000 rpm離心20 min，之后根據BCA 法進行蛋白濃度測定，添加5× 還原型上樣緩沖液，99 ℃煮蛋白10 min。根據蛋白濃度計算上樣量，添加蛋白樣品至10%～12%SDS－PAGE 凝膠中進行電泳，電泳結束后將膠中蛋白轉移至PVDF 膜上，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，與特異性一抗（Caspase－3、 Cleaved Caspase－3、 Bax、 Bcl－2、

Cytochrome C、β－actin）4 ℃孵育過夜，TBST 洗3 遍，10 min，與對應種屬二抗室溫孵育1 h，TBST 洗3 遍，10 min。ECL化學檢測法分析相應蛋白表達量。

2.6 數據處理與統計

采用SPSS 22.0 軟件和GraphPad 8.0 軟件對數據進行統計學分析和科研繪圖，所有數據以均數±標準差（±s）表示，滿足正態分布的多組數據比較采用單因素方差分析，事后檢驗方差齊性采用Turkey檢驗，方差不齊時采用Dunnetts' T3 檢驗。以P< 0.05 代表差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 環黃芪醇對HT22細胞活性的影響和保護作用

1～100μmol/L 濃度的環黃芪醇所處理的細胞沒有表現出明顯的毒性作用，而當濃度繼續增加達到150 μmol/L 以上時，其活性表現出下降趨勢，因此選擇50、75、100 μmol/L的環黃芪醇用于后續實驗。見表1。各組細胞經環黃芪醇和H2O2處理后，與空白組相比，H2O2組細胞存活率明顯降低（P<0.001）；而經環黃芪醇預處理的細胞可明顯減輕H2O2造成的細胞活性的損傷，其中100 μmol/L 濃度的環黃芪醇保護作用最強（P<0.001），表現出濃度依賴性。見表2。

表1 不同濃度環黃芪醇處理的HT22細胞存活率（±s）

表1 不同濃度環黃芪醇處理的HT22細胞存活率（±s）

濃度（μmol/L）0 1 5 10 25 50 75 100 150 200細胞存活率（%）100 96.52±2.88 102.62±14.34 104.39±18.46 101.56±17.94 100.19±21.30 100.65±23.18 102.67±20.10 76.54±17.65 62.02±15.72

表2 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞存活率的影響（±s）

表2 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞存活率的影響（±s）

注：與空白組相比，***P < 0.001；與H2O2組相比，##P < 0.01，###P <0.001。

組別空白組H2O2組H2O2+環黃芪醇50 μmol/L組H2O2+環黃芪醇75 μmol/L組H2O2+環黃芪醇100 μmol/L組細胞存活率（%）100 42.31±1.47***47.52±1.59##48.91±1.42###50.89±1.55###

3.2 環黃芪醇對H2O2處理的HT22 細胞中ROS 水平的影響

與空白組相比，H2O2組ROS 生成明顯增多（P<0.001）。與H2O2組相比，經不同濃度環黃芪醇預處理的HT22細胞中ROS生成均明顯減少，并呈現出一定的濃度依賴性（P<0.01，P<0.001，P<0.001）。見圖1、表3。

表3 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞活性氧產生情況的影響（±s）

表3 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞活性氧產生情況的影響（±s）

注：與空白組相比，***P < 0.001；與H2O2組相比，##P < 0.01，###P <0.001。

組別空白組H2O2組H2O2+環黃芪醇50 μmol/L組H2O2+環黃芪醇75 μmol/L組H2O2+環黃芪醇100 μmol/L組DCFH－DA活性氧平均熒光值8.31±1.53 34.96±4.51***21.56±5.59##12.57±2.11###6.65±1.23###

圖1 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞活性氧產生情況的影響

3.3 環黃芪醇對H2O2處理的HT22 細胞Nrf2 入核情況的影響

與空白組相比，H2O2組細胞Nrf2 入核減少（P<0.05）。與H2O2組相比，經不同濃度環黃芪醇預處理的HT22 細胞Nrf2 的入核呈增加趨勢，且表現出濃度依賴性（P<0.001）。見表4、圖2。

圖2 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞Nrf2入核情況的影響

表4 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞Nrf2入核情況的影響（±s）

表4 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞Nrf2入核情況的影響（±s）

注：與空白組相比，*P<0.05；與H2O2組相比，###P<0.001。

組別空白組H2O2組H2O2+環黃芪醇50 μmol/L組H2O2+環黃芪醇75 μmol/L組H2O2+環黃芪醇100 μmol/L組Nrf2核漿比3.03±0.21 2.16±0.31*3.65±0.22###4.15±0.24###4.96±0.22###

3.4 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22 細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

與空白組相比，H2O2組Cleaved Caspase－3/Caspase－3、Bax/Bcl－2、Cytochrome C 的表達量均增加（P< 0.05，P< 0.01，P< 0.05）。與H2O2組相比，經不同濃度環黃芪醇預處理的HT22 細胞中上述蛋白的表達量均有所下降。其中，H2O2+ 環黃芪醇50、75、100 μmol/L 組 中Cleaved Caspase－3/Caspase－3 的表達均明顯下降（P< 0.05，P< 0.01，P< 0.01）；H2O2+ 環黃芪醇75、100 μmol/L 組 中Bax/Bcl－2、Cytochrome C 的表達明顯下降（P< 0.01，P< 0.001）。見表5、圖3。

表5 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞凋亡相關蛋白相對表達量的影響（±s）

表5 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞凋亡相關蛋白相對表達量的影響（±s）

注：與空白組相比，*P<0.05，**P<0.01；與H2O2組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001。

組別空白組H2O2組H2O2+環黃芪醇50 μmol/L組H2O2+環黃芪醇75 μmol/L組H2O2+環黃芪醇100 μmol/L組Cleaved Caspase－3/Caspase－3 1.00±0.19 1.82±0.26*0.84±0.10#0.73±0.11##0.60±0.10##Bax/Bcl－2 1.00±0.14 1.66±0.14**1.18±0.25 0.99±0.32##0.79±0.26##Cytochrome C/β－actin 1.00±0.06 1.45±0.18*1.13±0.19 0.90±0.11##0.73±0.08###

圖3 不同濃度環黃芪醇對H2O2處理的HT22細胞凋亡相關蛋白相對表達量的影響

4 討論

氧化應激被認為是引起AD 的輔助因素，甚至是主要因素之一，對氧化應激進行干預可改善其病理結果［10］。活性氧（ROS）是正常代謝的副產品，在細胞信號轉導、穩態、自噬和細胞分裂中發揮重要作用。在生理條件下，低水平的ROS 快速產生和消除，并通過氧化還原穩態的過程嚴格調節。然而，當存在老化、遺傳或環境因素等不利條件時，氧化還原穩態被破壞，這將導致DNA 結構受損、膜紊亂、蛋白質結構和功能改變，使細胞損傷，細胞膜通透性增加，可引發凋亡［11-12］。H2O2是ROS 的常見形式之一，它可以輕易地穿透細胞質膜并影響鄰近的細胞［13］。因此，我們選擇H2O2處理小鼠海馬神經元細胞（HT22）以模擬體外氧化應激微環境。本次實驗結果表明，H2O2可誘導細胞產生更多的ROS 物質，而環黃芪醇可抑制這種作用，且隨著濃度的增加，抑制作用也會增強。

Caspases 屬于半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡的啟動和執行中起著關鍵作用。Caspase－3是凋亡的主要調控因子，負責凋亡通路的最后步驟［14］。Bcl－2是一種抗凋亡蛋白，可通過阻止細胞色素C 從線粒體釋放到細胞質中調節細胞凋亡。抗凋亡蛋白Bcl－2和促凋亡蛋白Bax 之間的平衡對于維持細胞正常的凋亡信號至關重要［15］。本次實驗結果顯示，環黃芪醇可降 低Cleaved Caspase－3/Caspase－3、Bax/Bcl－2 水平，減少細胞色素C 的表達，表現出抗凋亡作用，證明了環黃芪醇對H2O2誘導的細胞損傷具有保護作用。

Nrf2被認為是細胞外生物和氧化應激反應的主要協調者之一，可通過與抗氧化響應元件（ARE）結合，調節抗氧化、抗炎和解毒基因，進而調控氧化應激反應［16-17］。未被激活時，Nrf2在細胞質中被Keap1隔離并靶向于蛋白酶體降解。在氧化應激條件下，Nrf2－Keap1 相互作用以劑量依賴的方式分解，Nrf2 易位到細胞核中。此外，Nrf2 可調控氧化應激條件下的多種ROS 解毒酶的轉錄，控制GSH 等多種抗氧化系統關鍵組分的表達，在維持細胞氧化還原穩態中發揮重要作用［12，18］。本次實驗結果顯示，環黃芪醇可促進Nrf2 的入核，并表現出一定的濃度依賴性，這表明環黃芪醇可能通過調控Nrf2的激活發揮抗氧化作用。

綜上，環黃芪醇可減少H2O2處理的HT22 細胞中ROS的產生，并且可減少凋亡相關蛋白的表達，表現出一定的抗氧化損傷作用，環黃芪醇發揮抗氧化作用可能是通過刺激Nrf2 的入核、調節Nrf2 通路的激活來實現的。