不同等級藏茶抗氧化活性及抑菌能力對比研究

王 凝，張宇佳，蘭朝華，李林蔓，周小莉

（四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000）

引 言

藏茶是一種典型的黑茶，起源于四川雅安，又可被稱為磚茶、馬茶、黑茶、粗茶、大茶、南邊路茶等，是我國藏族人民的必備飲品［1］。據記載，藏茶自吐蕃時代以來傳承至今，已有1300年歷史，具有悠久的歷史背景和濃厚的文化底蘊［2］。長期以來，藏族人民主要生活在高寒、缺氧、強輻射的青藏高原地區，因此形成了以高油脂、高蛋白為主、果蔬較少的飲食結構。藏茶中的維生素、多糖、茶黃素、茶紅素、纖維素含量豐富，且有助消化的作用，對彌補藏區人民飲食結構不足、提高膳食纖維攝入有很大幫助，由此也形成了藏族人民對藏茶“寧可三日無糧，不可一日無茶”的高度評價。此外，大量現代科學研究證實，藏茶除了具有與其他茶類相同的作用和功效以外，還有著更為突出的保健功能，例如抗氧化、抗衰老、防輻射、減脂減肥、有效防止動脈粥樣硬化等［3-4］。

長期以來，藏茶和其它黑茶一樣，沿襲著粗茶粗作的制作工藝，采用粗老葉為原料進行渥堆發酵。隨著人們生活水平和市場需求的不斷提高，現代藏茶對原料篩選和制作工藝都逐漸由粗轉到細再到精。藏茶原料和制作的精細化，提升了成品茶的感官品質，使行業逐漸向高端化和品質化的產業升級方向發展。近幾年，由于陳香茶特有的保健功能，消費者們對它的喜歡愈加強烈，造成了其投資價值不斷上漲，從而陳香茶的市場迅速擴充。因此，傳統的邊銷藏茶也成為飲料市場的一個新亮點。然而，目前關于不同制作原料、不同陳化時間藏茶保健功能的研究相對較少，是否制作原料越嫩、存放時間越長，藏茶的保健功能越好，則有待進一步探究。

因此，通過對比不同制作原料、不同陳化年份藏茶水提物的總酚和類黃酮物質的含量，測定其鐵還原能力、羥自由基清除力以及ABTS+?自由基清除能力，從而探究不同等級藏茶的抗氧化活性；此外，利用打孔法測定不同等級藏茶水提物對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌抑菌圈的大小，對比其體外抑菌能力大小。研究旨在為藏茶的進一步開發和利用給出借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 不同等級藏茶

不同制作原料藏茶分別為T1：甘弘（一芽一葉，2018年產），T2：05（一芽3~5葉，2018年產），T3：07（一芽5~7葉，2018年產）；不同陳化年份藏茶分別為T4：07（一芽5~7葉，2015年產），T5：07（一芽5~7葉，2012年產）。以上藏茶均由雅安市友誼茶葉有限公司提供。

1.1.2 菌種

試驗所用大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌3個菌種均由四川輕化工大學微生物實驗室提供。

1.1.3 試劑

總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒、植物總酚檢測試劑盒、植物類黃酮含量檢測試劑盒以及羥自由基清除能力檢測試劑盒，均由北京索萊寶科技有限公司提供；總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法)，購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 藏茶水提取物制備

將不同等級的藏茶樣品粉碎，稱取茶末各10 g，按料液比1∶50加入蒸餾水，70 °C保溫浸提30 min，超聲波輔助二次浸提10 min，然后以5000 r/min的轉速離心10 min，取上清液并抽濾，之后將茶水置于旋轉蒸發儀濃縮，最后真空冷凍干燥成凍干粉備用。樣品使用前，用蒸餾水溶解茶粉配制成0.1 mg/mL藏茶水提物。

1.3 藏茶水提物總酚的測定

各種茶樣水提物均稀釋50倍，參照北京索萊寶科技有限公司《植物總酚檢測試劑盒說明書（分光光度法）》，各組水提物與反應液反應后，在波長λ=760 nm處測定吸光值，計算

以測得的ΔA'為Y值，代入標準曲線Y=5.615 X+0.0012，R2=0.9994，求得X。

其中：V樣總為提取液總體積，2.5 mL；V反總為反應物總體積，1 mL；V樣為反應物中樣品體積，0.05 mL；W為樣品質量，3 g；n為稀釋倍數，50。每個樣品設置3組平行對照試驗。

1.4 藏茶水提物類黃酮的測定

各種茶樣水提物均稀釋50倍，參照北京索萊寶科技有限公司《植物類黃酮含量檢測試劑盒說明書》，以單寧酸標準溶液制作標準曲線，Y=0.2887X-0.0472，R2=0.9979各組水提物與反應液反應后，在波長470 nm處測定吸光值，計算ΔA'=A測定-A對照，以測得的ΔA'為Y值，代入標準曲線，求X。測得

其中：V提取為提取液體積，150 mL；W為樣品質量，3 g；n為稀釋倍數，50。每個樣品設置3組平行對照試驗。

1.5 藏茶水提物抗氧化活性的測定

1.5.1 FRAR法測定抗氧化能力

各種茶樣水提物均稀釋50倍，參照北京索萊寶科技有限公司《總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒說明書》，以F eSO4標準溶液制作標準曲線為Y=10.829 X+0.0146，R2=0.9995，各組水提物與反應液反應后，在波長593 nm處測定吸光值，計算ΔA'=A測定-A對照，以測得的ΔA'為Y值，代入標準曲線，求X。測得總抗氧化能力

其中：V樣總為加入提取液體積，150 mL；V反總為反應總體積，0.204 mL；V樣為反應中樣品體積，0.006 mL；W為樣品質量，3 g。每個樣品設置3組平行對照試驗。

1.5.2 羥自由基清除能力的測定

各種茶樣水提物均稀釋50倍，參照北京索萊寶科技有限公司《羥自由基清除能力檢測試劑盒說明書》，各組水提物與反應液反應后，在波長536 nm處測定吸光值，測得羥自由基清除率：

1.5.3 ABTS+?清除能力測定

參照上海碧云天生物技術有限公司《總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS法）說明書》，配制ABTS工作母液。以Trolox標準溶液制作標準曲線為Y=0.5427X-0.017（R2=0.9936），各組水提物與工作液反應后，在波長734 nm處測定吸光值，根據標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力，樣品的抗氧化能力可以直接用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity（TEAC）來表示。

1.6 抑菌能力評估

1.6.1 菌種的活化及菌液的制備

將冷凍保存的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌菌種劃線接種至平板培養基，在37 °C條件下培養24 h，挑出單菌落接種至100 mL液體培養基，在37 °C條件下、200 r/min搖床培養過夜，得到備用菌液。

1.6.2 菌液最適濃度的確定

將菌液進行梯度稀釋，分別取20μL至固體培養基上，涂布均勻，置于37 °C生化培養箱中培養24 h后，查看稀釋涂布培養結果并確定最佳稀釋倍數。

1.6.3 抑菌圈的測定

取20μL最適濃度菌液在固體培養基上均勻涂布，用已滅菌的直徑為6 mm的培養基打孔器在試驗平板上打孔，往孔內注入30μL瓊脂培養基液體，待底部瓊脂冷卻凝固封底后，向孔內注入50μL藏茶水提物，在生化培養箱37 °C條件下培養24 h后，采用十字交叉法測定抑菌圈的大小。每個樣品設置3組平行試驗。

1.7 數據處理

每個試驗重復3次，結果用平均值±標準差表示。采用SPSS22.0軟件對數據進行Duncan統計分析，各組數據之間顯著性差異以不同小寫字母表示（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同等級藏茶水提物中總酚含量

植物酚類物質能夠清除自由基，具有抗氧化、抗衰老的作用，有極強的保健功效，特別是茶多酚是一類富含多羥基的酚類物質，能與茶水提取物中的亞鐵離子發生綜合反應，其含量大約是茶葉干重的18%~36%［5］。目前，有大量研究發現茶多酚具有抗菌、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、防輻射、降血脂血糖、防動脈粥樣硬化、防齲齒和增強免疫力等多種調節功效［6］。其作用廣泛，功效清楚，機理明確，能夠作為一種十分理想的食品生產原料［7］。茶的抗氧化作用即與茶多酚的含量有密切的關聯。

不同等級藏茶水提物總酚含量如圖1所示。由圖1可知，藏茶水提物總酚含量因等級不同而有所變化。不同制作原料藏茶總酚含量差異顯著（P<0.05）：T1（（19.64±0.67）mg/mL）＞T2（（17.42±0.59）mg/mL）＞T3（（16.36±1.04）mg/mL），說明藏茶原料隨著每芽葉數的增多，酚類物質含量逐漸降低。不同陳化年份藏茶總酚含量分別為T3（（16.36±1.04）mg/mL）＞T4（（13.61±1.13）mg/mL）＞T5（（12.19±0.82）mg/mL），這表明隨著陳化時間增加，藏茶中總酚含量顯著下降，這一結果與普洱和茯苓磚茶相似［8-9］。周紅杰等［8］通過研究發現，普洱茶經過渥堆發酵之后，茶葉中水化果膠、碳水化合物和水提取物含量均會增加，而茶多酚會降解，這些變化都會直接表現在普洱茶風味甘甜、絲滑、味醇且厚的特征上，而這些物質含量的增減對普洱茶品質特征形成都是有益的。黃景源［9］研究發現，隨著陳放時間的增加，茯苓磚茶干茶及葉底色澤方面會發生明顯變化，品質成分方面，茶多酚、氨基酸含量會隨著陳放時間的延長而減少，而水溶性糖的含量則相反。茶多酚含量的減少會有益于茶葉的苦澀味減少，水溶性糖含量的提高則可以增強甘味［10-11］。

圖1 不同等級藏茶水提物總酚含量

2.2 不同等級藏茶水提物中類黃酮的含量

黃酮類物質在自然界分布廣泛，具有多方面的功效，可有效防治機體的呼吸系統、心腦血管系統的病變，有抗氧化、抑菌、抗病毒、抗癌、抗腫瘤、抗過敏、降低血糖血壓以及增強機體免疫力等功效，且對機體不會有任何不利影響，黃酮類物質含量的高低能直接影響其生理活性［12-15］。藏茶中的類黃酮類主要是黃烷醇和黃酮醇，如兒茶素、四羥基黃酮、茶紅素、茶黃素等。

對不同等級藏茶水提物中類黃酮含量進行測定，結果如圖2所示。由圖2可以看出，T1、T2、T3分別為（32.92±1.48）mg/mL、（29.76±1.25）mg/mL、（28.96±0.65）mg/mL，T1與T2、T3差異顯著（P<0.05），而T2與T3之間差異不顯著（P>0.05），相較于T3、T4和T5類黃酮含量顯著降低，這可能是由于藏茶在貯藏陳化階段，在環境和微生物的共同作用下，發生了氧化、縮合、水解等反應，因此類黃酮成分被利用或降解，故陳年藏茶的類黃酮含量相對較低。

圖2 不同等級藏茶水提物類黃酮含量

2.3 不同等級藏茶水提物抗氧化活性

2.3.1 FRAR法測定不同等級藏茶水提物抗氧化能力

由標準曲線算得不同等級藏茶水提物對鐵還原能力如圖3所示。由圖3可以看出，T1（（55.37±3.41）U/g）＞T2（（52.28±2.71）U/g）＞T3（（52.21±2.83）U/g），因此制作原料葉片越嫩，其對鐵的還原能力越強；而藏茶貯藏陳化時間越長，對鐵的還原能力越弱，其中T4對鐵的還原能力為（43.17±2.92）U/g，較T3降低了17.31%，而T5為（38.86±2.32）U/g，較T3降低了25.57%。

圖3 不同等級藏茶水提物對鐵的還原能力

2.3.2 不同等級藏茶水提物對羥基自由基清除率

羥基自由基是一種氧化活性極強的自由基，可與蛋白質、多肽、脂質以及DNA等生物大分子物質產生反應，對人體細胞、組織、器官均可造成一定程度損傷。檢測樣品對羥基自由基的清除活性可作為衡量其抗氧化活性的方法［16］。

不同等級藏茶水提物對羥基自由基清除率結果如圖4所示。由圖4可以看出，T1（7.48±1.02%）＞T2（6.48±0.50%）＞T3（6.41±0.56%）＞T4（5.87±1.27%）＞T5（4.54±0.59%），這表明在不同制作原料藏茶中，葉片越嫩，羥基自由基清除率越高；同種藏茶陳化時間越長，羥基自由基清除能力越低（圖4）。

圖4 不同等級藏茶水提物對羥自由基清除率

2.3.3 不同等級藏茶水提物對ABTS+?的清除能力

不同等級藏茶水提物對ABTS+?的清除能力如圖5所示。由圖5可以看出，不同等級藏茶水提物ABTS+?清除能力差異顯著（P<0.05），T1為（33.44±1.93）mmol/（0.02 g/mL），高于T2（（31.90±2.58）mmol/（0.02 g/mL））和T3（（29.99±1.65）mmol/（0.02 g/mL）），這說明藏茶制作用料越嫩，其水提物ABTS+?清除能力越強；而T4（（23.34±1.43）mmol/（0.02 g/mL））較T3 ABTS+?清除能力下降22.16%，T5（（21.40±2.21）mmol/（0.02 g/mL））較T3下降28.63%。

圖5 不同等級藏茶水提物對ABTS+·清除能力

2.4 不同等級藏茶水提物抑菌能力

不同等級藏茶水提物對不同病原菌都有一定的抑制作用，其抑菌能力見表1。由表1可知，藏茶對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小為（15.17±0.73）mm~（18.25±1.43）mm，顯著大于大腸桿菌和沙門氏菌。對于同一病原菌的抑制效果，不同制作原料藏茶T1、T2、T3間差異不顯著；而不同陳化時間藏茶T3、T4、T5之間，貯藏陳化時間延長，對病原菌的抑菌能力增強。

表1 不同等級藏茶水提物抑菌圈大小（單位：mm）

3 討 論

截至2019年，我國黑茶總產量達37.81萬噸，超越紅茶位居第二，成為茶飲料市場的消費熱點。其中，四川黑茶產量全國第四，達到3.32萬噸。作為四川黑茶的代表，藏茶具有極高的市場潛力和商業價值。隨著人們消費需求的不斷提升，藏茶的保健功能逐步被挖掘。因此，探究不同等級藏茶的抗氧化活性及抑菌能力，對進一步開發藏茶的保健功能和市場價值具有重要意義［17］。

隨著市場需求的不斷提高，藏茶的制作原料由早年的“粗枝大葉”逐步向細嫩芽葉發展，加工工藝也更加精細化、工業化、標準化。藏茶渥堆發酵工藝過程中，鮮葉的基礎物質含量與后發酵轉化效率及成品茶風味物質有著密切的聯系［18］。選用嫩葉作為藏茶的制作原料，可以提高其品質、色澤和香味［19］，并且能有效防止氟超標，但是否會影響其保健功能，則需進一步探究。徐雪萍［20］、張秀芬等［21］發現，茶葉中水溶性膳食纖維（SDF）和非水溶性膳食纖維（IDF）清除3種自由基的活性以及總抗氧化能力與茶葉的嫩度有密切關聯，茶葉葉片越嫩，自由基清除力和總抗氧化能力也越高。呂海鵬等［22］測定了茶葉的抗氧化能力與普洱茶等級之間的關系，研究發現普洱茶的等級越高，其總抗氧化活性越強，對羥自由基和DPPH自由基清除活性也越強。本研究基于以上3種方法比較不同等級藏茶水提物的抗氧化活性，結果均顯示不同制作原料藏茶，選用茶葉越嫩，則其抗氧化活性越強，與之前的研究結果相類似，這可能與嫩葉中高含量酚類和類黃酮類物質有關。

近年來，國內外茶葉市場上黑茶“越陳越香”的觀點日益普遍，因此造成了消費者對陳年茶的購買熱情愈加強烈［23］。黑茶經過長期儲存，其內含物質如糖類、茶多酚、氨基酸、生物堿及芳香物質會發生一系列復雜的生物化學和熱化學反應，同時直接表現在色、香、味的感官變化上，其營養價值和保健功能也同時發生改變［9，22，24-25］。戚康標等［26］對不同儲存年份普洱茶的生化成分及抗氧化活性進行了測定，研究發現生茶的抗氧化活性高于熟茶，而普洱茶的陳化時間越長，其抗氧化活性越低，這是由于茶多酚的含量減少而引起的。陳年藏茶缺少了新茶所特有的鮮甜味和回甘的特點，但水浸出物、茶褐素含量減少，茶黃素、茶紅素含量增加，茶多酚含量穩定，使其湯色呈現紅褐色，滋味醇厚卻不苦澀［27］。通過分別對不同陳化時間的藏茶抗氧化活性進行評估，發現陳化時間越長，藏茶的抗氧化性越弱，這可能與藏茶中酚類和類黃酮類物質被進一步分解有關。然而陳化后藏茶的抑菌能力有所提高，尤其是對金黃色葡萄球菌的抑制作用，這和對陳化后茯磚茶的研究結果不同［28］。可能是藏茶陳化時期，其中的優勢微生物及其代謝產物對病原菌有抑制能力造成的。

4 結束語

藏茶制作原料越嫩，其水提物總酚、類黃酮含量越高，體外抗氧化活性也越強；總酚、總黃酮的含量隨藏茶陳化時間的延長而降低，體外抗氧化活性也顯著下降；藏茶對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，不同制作原料藏茶的抑菌能力差異不顯著，而陳化時間越長，藏茶抑菌能力越強。本研究對不同等級藏茶的活性成分、體外抗氧化活性及抑菌能力進行了初步探究，而其對于人體的保健功效，還有待進一步驗證。本研究對進一步了解藏茶的保健功能，開發“精制茶”和“陳年茶”均具有一定借鑒意義。