HPLC 法測(cè)定復(fù)方鮮竹瀝液中2,6-二甲氧基苯酚的含量

黃東，肖小武，周志強(qiáng)，付輝政，許妍，洪挺

江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330029

復(fù)方鮮竹瀝液是根據(jù)浙江省中醫(yī)院楊繼蓀院長(zhǎng)提供的經(jīng)驗(yàn)方，由浙江省中醫(yī)院、浙江省醫(yī)學(xué)研究院與杭州天目山藥業(yè)股份有限公司共同研制而成的合劑，處方由鮮竹瀝、枇杷葉、魚(yú)腥草、桔梗、生半夏、生姜、薄荷素油七味藥組成。處方中鮮竹瀝為君藥，性寒滑利，清肺降火，化痰止咳。魚(yú)腥草和枇杷葉共為臣藥，清熱解毒，化痰止咳。桔梗宣肺利咽，化痰止咳；生半夏燥濕化痰；生姜既可佐助君藥化痰之力，又可佐制生半夏毒性，共為佐藥。全方各藥共奏清熱化痰、止咳之功效［1］。復(fù)方鮮竹瀝液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2015年版一部，標(biāo)準(zhǔn)只收載有魚(yú)腥草、枇杷葉和桔梗的薄層色譜鑒別以及合劑常規(guī)檢查項(xiàng)［2］，標(biāo)準(zhǔn)過(guò)于簡(jiǎn)單，且對(duì)占處方量40%的君藥鮮竹瀝沒(méi)有任何質(zhì)控指標(biāo)，不能真實(shí)地反應(yīng)該產(chǎn)品的質(zhì)量。有文獻(xiàn)報(bào)道愈創(chuàng)木酚類(lèi)酚性成分為鮮竹瀝祛痰鎮(zhèn)咳活性成分［3-7］，《中國(guó)藥典》2015年版一部中“祛痰靈口服液”品種項(xiàng)下，有以“愈創(chuàng)木酚”為指標(biāo)控制鮮竹瀝質(zhì)量，現(xiàn)今關(guān)于該復(fù)方鮮竹瀝液處方質(zhì)量研究的文獻(xiàn)很少［8-11］。為控制復(fù)方鮮竹瀝液中君藥鮮竹瀝的質(zhì)量，本研究運(yùn)用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定復(fù)方鮮竹瀝液中君藥鮮竹瀝中2，6-二甲氧基苯酚的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

賽默飛Ultimate 3000 高效液相色譜儀，TE212-L型十萬(wàn)分之一天平（德國(guó)賽托利斯公司）。

1.2 試劑

復(fù)方鮮竹瀝液（A 公司，批號(hào)190902、191206、191208；B 公司，批 號(hào)191235、B 191145；C 公司 20200211、20200212、20200302）；2，6-二甲氧基苯酚對(duì)照品（Stanford Chemicals 提供，批號(hào)MA190816-07，含量為98.0%）。乙腈為色譜純，Milli-Q Directl 6超純水儀（德國(guó)默克密理博公司），其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

取2，6-二甲氧基苯酚對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加適量甲醇制成20 μg/mL 的2，6-二甲氧基苯酚對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的配制

吸取復(fù)方鮮竹瀝液20 mL，置分液漏斗中，加稀鹽酸調(diào)pH 至1～2，搖勻，再用乙醚萃取3 次，每次30 mL，合并乙醚提取液，提取液再用5%的碳酸氫鈉溶液20 mL 洗滌，分取乙醚層，揮干，殘?jiān)眠m量甲醇溶解轉(zhuǎn)移至2 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性

色譜柱：ACE C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～20 min，A：7%→21%；20～30 min，A：21%→29%）；檢測(cè)波長(zhǎng)為201 nm；柱溫箱30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。按照該色譜條件進(jìn)行測(cè)定，理論塔板數(shù)按2，6-二甲氧基苯酚峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。色譜圖中顯示其他組分對(duì)2，6-二甲氧基苯酚色譜峰無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)方鮮竹瀝液HPLC色譜圖：A.2，6-二甲氧基苯酚對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.缺鮮竹瀝陰性對(duì)照溶液

2.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察

精密稱(chēng)取2，6-二甲氧基苯酚對(duì)照品10.85 mg，置于50 mL 容量瓶，加適量甲醇超聲溶解，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。再精密吸取配制的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成5個(gè)系列濃度，再按正文“2.3”項(xiàng)下的HPLC 色譜條件進(jìn)行線(xiàn)性關(guān)系測(cè)定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)2，6-二甲氧基苯酚的線(xiàn)性回歸方程為Y=284.69X-1.575 3，r=0.999 9，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算得到2，6-二甲氧基苯酚在0.043～0.43 μg 之間具有良好線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取配制的對(duì)照品溶液，按照上述“2.3”條件連續(xù)進(jìn)樣，測(cè)得6 次峰面積。再計(jì)算6 次2，6-二甲氧基苯酚峰面積的RSD 為0.5%，表明儀器精密度符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取6 份復(fù)方鮮竹瀝液（批號(hào)：191206）樣品各20 mL，按供試品制備方法，制備得到供試品溶液，再按HPLC 液相色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算結(jié)果顯示2，6-二甲氧基苯酚平均值為15.99 μg/mL，其RSD 為1.5%，表明所建立的方法重復(fù)性符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下制備的供試品溶液，分別在1、2、3、6、9、12、24 h 測(cè)定2，6-二甲氧基苯酚峰面積，測(cè)定結(jié)果顯示其面積的RSD 為0.8%（n=7），說(shuō)明2，6-二甲氧基苯酚在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密量取復(fù)方鮮竹瀝液（批號(hào)：191206）10 mL，各6 份，分別加入2，6-二甲氧基苯酚對(duì)照品溶液10 mL（0.016 17 mg/mL），用稀鹽酸調(diào)pH 至1～2，搖勻，再按上面“2.2”方法制備，得到供試品溶液。依次精密吸取5 μL供試品溶液，進(jìn)行HPLC色譜分析測(cè)定，計(jì)算回收率。計(jì)算結(jié)果顯示2，6-二甲氧基苯酚的平均回收率為97.3%（n=6），RSD 為1.7%。詳見(jiàn)表1。

表1 2，6-二甲氧基苯酚回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.9 樣品測(cè)定

分別取A、B、C 三家生產(chǎn)企業(yè)的復(fù)方鮮竹瀝液樣品適量，按照“2.2”項(xiàng)下處理方法，每份樣品平行處理2 份，得供試品溶液，再按“2.3”液相色譜條件進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品的測(cè)定結(jié)果（μg/mL）

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)方法考察

對(duì)新建的含量測(cè)定方法，分別考察了不同pH：用稀鹽酸分別調(diào)pH 值至1～2、2～3、3～4，結(jié)果顯示調(diào)節(jié)pH 值至1～2 時(shí)，供試品色譜峰峰面積最大；考察了碳酸氫鈉用量：分別使用5%碳酸氫鈉0、10、20、30、60 mL，結(jié)果顯示使用20 mL 時(shí)，供試品峰面積最大；考察了乙醚萃取次數(shù)：分別使用乙醚萃取1 次、2 次、3 次、4 次，結(jié)果顯示萃取3次已基本萃取完全。故最終確定實(shí)驗(yàn)方法為使用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至1～2，用乙醚振搖提取3 次，用5%的碳酸氫鈉溶液20 mL 洗滌。

3.2 2，6-二甲氧基苯酚的選擇

鮮竹瀝為禾本科植物粉綠竹Phyllostachys glaucaMcCluve、凈 竹Phyllostachys nudaMcClure及同屬植物的鮮桿經(jīng)加熱后自然瀝出的液體［12］。鮮竹瀝傳統(tǒng)炮制方法歷代本草均有記載，主要有兩種方法，一種方法為：“將竹截作二尺長(zhǎng)，辟開(kāi)。以磚兩片對(duì)立，架竹于上。以火炙出其瀝，以盤(pán)承取”，簡(jiǎn)稱(chēng)直接火燒法；另一種方法為：“以竹截長(zhǎng)五六寸，以瓶盛，倒懸，下用一器承之，周?chē)蕴炕鸨浦溆蜑r于器也”，簡(jiǎn)稱(chēng)裝盤(pán)倒懸炭火逼制法。前期課題組自制了直接火燒法34 批次，干餾法27 批次鮮竹瀝，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，均含有酚性成分，且以2，6-二甲氧基苯酚含量最大，且有文獻(xiàn)報(bào)道鮮竹瀝和復(fù)方鮮竹瀝液中均含有愈創(chuàng)木酚類(lèi)祛痰鎮(zhèn)咳活性成分［3-7］，故選擇其作為質(zhì)控指標(biāo)。

3.3 結(jié)果分析

從檢測(cè)結(jié)果可看出，A 和B 公司不同批次復(fù)方鮮竹瀝液2，6-二甲氧基苯酚含量差異較大，說(shuō)明使用鮮竹瀝質(zhì)量差異較大。C 公司未檢出2，6-二甲氧基苯酚，因鮮竹瀝在處方中為原液直接入藥，這說(shuō)明其使用鮮竹瀝不含2，6-二甲氧基苯酚，質(zhì)量存在問(wèn)題。