阿奇霉素顆粒（Ⅱ）微生物限度檢查方法學驗證

黃霖，王杰，漆鳳梅，劉緒平，霍曉菲

1.景德鎮市市場監督管理綜合檢驗檢測中心，江西 景德鎮 333000；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029；3.江西中醫藥大學,江西 南昌 330004

阿奇霉素(Azithaxmaycin)是一種半合成的大環內酯類抗生素,它是作用于細菌細胞核糖體50 s 亞單位,阻礙細菌蛋白質合成,起到抑菌作用［1］。對革蘭陽性球菌、陰性球菌、部分革蘭陰性桿菌具有明顯的抗菌效果,適應證為中耳炎、鼻竇炎、咽炎、扁桃體炎等上呼吸道感染及支氣管炎、肺炎等下呼吸道感染,皮膚和軟組織感染,沙眼衣原體所致單純性生殖器感染等［2-6］。阿奇霉素具有較強的抗菌活性,薄膜過濾法可有效地除去其抗菌成分［7］。本實驗對通過薄膜過濾法除去阿奇霉素顆粒（Ⅱ）的抗菌活性并進行微生物限度檢查法進行驗證,確保阿奇霉素顆粒（Ⅱ）微生物限度檢查符合要求［8］,增強制劑用藥安全。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高壓蒸汽滅菌器（型號:YXQ-LS-50S Ⅱ），電子天平（型號：Quintix 6101-1CN），凈化工作臺（型號：SW-CJ-2D），細菌培養箱（型號：HWS-250），霉菌培養箱美國賽默飛（型號：3758CN），集菌儀（型號:杭州泰林MZ-601）。

1.2 試藥

阿奇霉素顆粒（Ⅱ）（江西億友藥業有限公司，批號20191101、20191102、20191103，規 格：1 g∶100 mg），pH 7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號200630-9，江蘇益碼）

1.3 培養基和菌種

見表1，2。

表1 培養基信息

表2 菌種信息

2 方法

2.1 菌液的制備

按照《中國藥典》2015年版四部通則1105 檢查項中的方法,將各試驗菌制成50～100 cfu/mL 的菌懸液。各試驗菌株均為第2 代菌。

2.2 微生物限度檢查方法驗證

2.2.1 供試液制備 取阿奇霉素顆粒（Ⅱ）（批號20191101）10 g，置無菌錐形瓶中，加入pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，振搖溶解，作為1∶10 供試液；取1∶10 供試液10 mL，置無菌錐形瓶中，加入pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 mL，搖勻，作為1∶100 供試液。

2.2.2 預實驗 參照《中國藥典》2015年版四部通則1105 及阿奇霉素的抗菌特性選取敏感菌金黃色葡萄球菌、白色念珠菌進行預試驗，結果詳見表3。

表3 預試驗的結果

預實驗結果表明，阿奇霉素顆粒（Ⅱ）對金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，而對白色念珠菌沒有明顯的抑制作用，因此采用薄膜過濾法（1∶100的供試液1 mL，沖洗500 mL）進行需氧菌總數計數，采用平皿法（1∶10 的供試液）進行霉菌和酵母菌總數計數。

2.2.3 計數方法適用性試驗（1）需氧菌總數計數法。取上述制備好的1∶100 供試液1 mL 加入到裝有50 mL 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的薄膜過濾器中，混勻,全量通過濾膜后,再用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 mL 沖洗,沖洗3 次，每次100 mL，在最后一次沖洗液中加入試驗菌（≤100 cfu），濾干，立即貼膜于預制好的TSA 平板上，置33.0 ℃培養箱培養24 h～72 h，逐日觀察結果。以稀釋液代替菌液，其他操作同上述操作，作為供試品組。以稀釋液替代供試液，其他操作同上述操作，作為供試品菌液組。

試驗組菌回收率=（試驗組菌數-供試品本底菌數）/菌液對照組菌數×100%。根據回收率公式計算回收率，結果見表4。如表4 所示，本品采用薄膜過濾法（1∶100 供試液，500 mL/筒）檢查需氧菌總數，各需氧菌的回收率在0.5～2.0 的范圍內均符合藥典規定。

表4 需氧菌總數驗證結果（n=3）

（2）霉菌和酵母菌總數計數法。取1∶10 的供試液9.9 mL 分別置2 支試管中,每支試管中加入試驗菌液0.1 mL，使供試液中含菌量不大于100 cfu/mL，搖勻。取上述試液注入2 個平皿（1 mL/皿），加入15 mL SDA 至平皿中，置23 ℃培養箱培養24 h～120 h，逐日觀察結果。以稀釋液代替菌液，其他操作同上述操作，作為供試品組。以稀釋液替代供試液,其他操作同上述操作，作為供試品菌液組。

根據回收率公式計算回收率,結果見表5。如表5 所示,本品采用常規法檢查霉菌和酵母菌總數，白色念珠菌和黑曲霉的回收率在0.5～2.0 的范圍內均符合藥典規定。

表5 霉菌和酵母菌總數驗證結果（n=3）

2.2.4 控制菌（大腸埃希菌）檢查 取1∶10 的供試液10 mL，薄膜過濾，用pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 mL 沖洗，每次100 mL，在最后一次沖洗液中加入大腸埃希菌試驗菌（≤100 cfu）,取濾膜加入加入TSB 100 mL，然后照《中國藥典》2015年版四部通則1106 控制菌檢查法依法操作。檢查陽性對照組、陰性對照組、供試品對照組、試驗組。結果見表6，表明阿奇霉素顆粒（Ⅱ）在該條件下，對大腸埃希菌無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計。說明可以采用該法進行阿奇霉素顆粒（Ⅱ）的大腸埃希菌檢查。

表6 大腸埃希菌檢查方法驗證結果

2.3 樣品微生物限度檢查

采用建立的方法對三批阿奇霉素顆粒（Ⅱ）進行需氧菌總數的檢查、霉菌和酵母菌總數及控制菌的檢查，結果見表7。結果表明,建立的檢查方法可用于阿奇霉素顆粒（Ⅱ）微生物限度的檢查。

表7 3 批樣品微生物限度檢查結果

3 討論

在臨床用藥中由于微生物污染引起的藥源性不良反應和疾病時有發生，主要通過產生有毒的代謝產物和分解藥物的有效成分，從而使藥效降低和影響患者健康，因此藥品的微生物限度檢查在控制藥物質量和保證用藥安全中起著至關重要的作用。

阿奇霉素屬于大環內酯類抗菌藥物，通過阻礙細菌轉肽過程抑制細菌蛋白質的形成。體外實驗證明阿奇霉素對臨床上多種常見致病菌有效，主要用于革蘭陽性菌等引起的感染，屬于速效抑菌劑。本實驗通過預實驗也表明阿奇霉素對細菌有較強的抑菌性，因此選擇薄膜過濾法進行了細菌限度檢查方法研究［9-10］。阿奇霉素對霉菌和酵母菌沒有抑制作用，霉菌及酵母菌計數檢查采用平皿法驗證［11］。控制菌（大腸埃希菌）在常規法中，由于阿奇霉素的抑菌性，實驗組未檢出大腸埃希菌，MUG-靛基質試驗顯陰性。因此，采用薄膜過濾法，進行控制菌檢查。通過本實驗的研究，建立了阿奇霉素顆粒（Ⅱ）微生物限度檢查方法并進行驗證，回收率符合藥典規定，表明建立的方法是可靠的。該方法能進一步有效地保證藥品的安全性，并且對建立其他大環內酯類抗生素微生物限度檢查法具有一定的幫助。