葛根素對T2DM小鼠的改善作用

謝明杰， 趙龍昊

(遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081)

隨著經濟發展和人們生活水平的提高，2型糖尿病(T2DM)的發病率呈逐年上升的趨勢，已成為威脅全球人類健康的慢性非傳染性疾病[1].已有的研究表明，T2DM的發病機制十分復雜，與基因調控、腸道菌群和代謝水平等多因素影響有關[2].葛根為我國傳統的中藥材，將其用于治療糖尿病在我國有著悠久的歷史[3].本文以葛根的主要功效成分葛根素為實驗材料，采用多組學策略，通過測定并分析葛根素對T2DM小鼠腸道菌群、代謝物和腸道基因表達水平的影響，探討其調節T2DM小鼠糖代謝的作用機制.旨在為將葛根素開發為治療糖尿病的臨床藥物或保健藥物提供理論依據.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性昆明小鼠，體質量(20±2) g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司.

1.1.2 實驗藥品

葛根素：純度>98%，購自成都曼斯特生物科技有限公司；鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)購自上海生工生物工程有限公司；小鼠胰島素(insulin, INS)酶聯免疫檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所.

1.1.3 實驗儀器

Illumina MiSeq DNA測序儀，美國Illumina公司；酶標儀，美國Thermo公司；PCR擴增儀，美國ABI公司；血糖儀，江蘇魚躍醫療設備股份有限公司.

1.2 方法

1.2.1 T2DM小鼠模型的建立及分組

將小鼠隨機分為正常組(NM)和造模組，分別喂飼基礎飼料和高糖高脂飼料.5周后禁食但不禁水12 h，造模組連續5 d腹腔注射1%(質量分數)STZ溶液40 mg/kg，NM組注射等體積檸檬酸緩沖液.最后一次注射72 h后，尾靜脈采血所測得的血糖值>11.1 mol/L視為造模成功.將造模成功的小鼠再分為模型組(DM)和葛根組(Pue)，每組各6只.其中，Pue組小鼠按50 mg/kg/d灌胃葛根素藥液0.2 mL，連續5周，NM組及DM組小鼠灌胃等體積蒸餾水.

1.2.2 小鼠血液相關指標的檢測

待灌胃5周后取小鼠眼底靜脈血，按照試劑盒說明收集血清，分別檢測小鼠空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)、空腹胰島素(fasting insulin, FINS)水平，并按下列公式計算胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance, HOMA-IR)和胰島素敏感指數(insulin sensitivity index, ISI)：

HOMA-IR=(FINS×FBG)/22.5，

ISI=ln[1/(FINS×FBG)].

1.2.3 小鼠胰腺組織切片的制備與觀察

將小鼠胰腺組織先放于Bouin液中固定，然后通過脫水、透明、浸蠟、包埋、脫蠟、染色、封片等步驟制作石蠟切片，于光學顯微鏡下進行觀察.

1.2.4 小鼠糞便和腸道組織的收集與保存

收集各組小鼠的新鮮糞便和小腸組織，將其在液氮速凍后于-80 ℃保存.采用Illumina MiSeq平臺和LC-MS技術對樣品進行腸道菌群測序、轉錄組測序和非靶向代謝物測定.樣品的檢測委托上海派森諾生物科技有限公司完成.

1.2.5 生物信息學分析

腸道菌群測序采用QIIME2軟件、R腳本進行分析；轉錄組測序采用HTSeq、Sringtie等軟件進行分析；代謝物測定采用Proteowizard、R腳本等軟件進行分析.使用R軟件計算各組學數據之間的等級相關系數.

1.2.6 統計學分析

采用SPSS21.0統計軟件進行數據統計分析.組內比較采用單因素方差分析，組間采用t檢驗.P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著.

2 結果與分析

2.1 葛根素對小鼠血糖水平的影響

實驗結果顯示(表1)，葛根素能顯著降低T2DM小鼠的血糖水平.其中，與DM組相比，Pue組小鼠的FBG和FINS分別下降了41.35%和29.66% (P<0.01).

表1 葛根素對小鼠血糖水平的影響

2.2 葛根素對小鼠胰腺組織的影響

小鼠胰腺組織切片結果顯示(圖1)，NM組小鼠的胰島結構完整且規則，而DM組小鼠的胰島結構被破壞，形狀不規則，與周圍組織混合難以識別.但用葛根素灌胃5周后，T2DM小鼠損傷的胰腺組織得到了很好的修復.

圖1 小鼠胰腺組織切片(×400)Fig.1 Sections of mice pancreas tissues (×400)

2.3 葛根素對小鼠腸道菌群的影響

Illumina檢測結果顯示，葛根素能顯著改變小鼠腸道菌群的物種組成.與DM組相比，Pue組小鼠腸道菌群的物種組成在門、目、屬水平上均發生了顯著的變化.但當利用葛根素灌胃T2DM小鼠5周后，可使DM組小鼠腸道菌群的物種組成基本恢復至正常水平(圖2a).圖2b為選取豐度變化位列前50的菌屬所做的熱圖.紅色表示豐度高，藍色表示豐度低，顏色的深淺表示變化的強弱.由圖可知，與NM組相比，DM組小鼠中的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、螺桿菌屬(Helicobacter)、Dorea、Mucispirillum、Prevotella、厭氧棍狀菌屬(Anaerotruncus)、帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)等的豐度明顯升高.當用葛根素灌胃T2DM小鼠5周后，Pue組小鼠腸道菌群的物種組成基本恢復至正常水平.其中，脫硫弧菌屬、螺桿菌屬、Dorea的豐度明顯降低，而乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、Alistipes、丁酸弧菌屬(Butyricimonas)等益生菌的豐度明顯升高.

2.4 葛根素對小鼠代謝物的影響

按照P≤0.05且VIP≥1的標準進行篩選，與DM組相比，Pue組共篩選出505 個差異顯著代謝物，包括193個上調代謝物，312個下調代謝物.按照分子量與數據庫中的代謝物進行匹配，共鑒定出5-羥基-L-色氨酸等19種差異顯著代謝物.其中，與DM組相比，Pue組中的5-羥基-L-色氨酸和褪黑素等代謝物的含量顯著升高，苯乙酰谷氨酰胺等代謝物的含量顯著降低.

2.5 葛根素對小鼠腸道基因表達水平的影響

按照表達差異倍數|lb FoldChange|>1和P<0.05的條件進行篩選，與DM組相比，Pue組共篩選出308個差異顯著基因,包括204個上調基因，104個下調基因.其中，與DM組相比，Pue組中的Slc2a2、Haao、Foxa2、Slco4c1、Mbl2等基因的表達水平顯著增加，Srebf1等表達水平顯著降低.

3 討 論

已有的研究結果表明，腸道菌群結構功能的紊亂與T2DM等多種疾病密切相關[4].如糖尿病患者常伴有腸道菌群比例的失衡，表現為擬桿菌門和厚壁菌門的豐度比值明顯降低，梭菌與厚壁菌的比值明顯升高等[5-6].本研究結果顯示，葛根素可通過改變擬桿菌門與厚壁菌門的比例，降低脫硫弧菌屬、螺桿菌屬等有害菌群的豐度，提高雙歧桿菌屬、乳球菌屬、乳桿菌屬等益生菌群的豐度，使T2DM小鼠腸道菌群的物種組成基本恢復至正常水平.

代謝物的變化可從一定程度上反映內外源物質在生物體內的作用機制[7-9].5-羥基-L-色氨酸為血清素的前體物質，血清素能促進棕色脂肪組織攝取葡萄糖并將其轉化為熱能.有研究報道，5-羥基-L-色氨酸和褪黑素具有促進胰島素分泌、糖原合成和糖酵解等作用，能顯著改善高脂小鼠的葡萄糖耐受性，增強胰島素敏感性，對T2DM的發生和發展具有很好的調節作用[10-11].苯乙酰谷氨酰胺是腸道菌群分解苯丙氨酸時產生的副產物，有研究結果顯示，在患有T2DM的受試者血漿中檢測出較高濃度的苯乙酰谷氨酰胺，其過高的含量可作為發生心肌梗死等風險的獨立預測因子[12].本研究結果表明，葛根素可通過影響5-羥基-L-色氨酸、褪黑素和苯乙酰谷氨酰胺等代謝物的含量改善小鼠的T2DM.

給藥前后小鼠基因組mRNA表達水平的變化，可為探討葛根素治療T2DM的機制以及尋找藥物作用的靶點提供有力的支持[13].Slc2a2是青少年成熟型糖尿病代謝通路中的調控基因，主要參與編碼葡萄糖轉運體蛋白2.該蛋白缺失會使葡萄糖攝取受損、胰島素分泌不足，最終導致高血糖的發生[14].Haao是調控NAD合成的關鍵基因，而NAD是三羧酸循環的重要輔酶，在促進機體的糖脂代謝中發揮重要作用[15].有研究報道:在胰島素抵抗和肥胖小鼠中，增加由Foxa2編碼的Foxa2活性，可使其對胰島素的敏感性增強，降低血漿胰島素和甘油三酯的含量[16-17]；由Slco4c1編碼的Slco4c1蛋白可減輕糖尿病大鼠腎小球足細胞線粒體功能障礙，對糖尿病腎病的改善起著關鍵作用[18]；由Mbl2編碼的甘露糖結合蛋白(mannose-binding lectin, MBL)可控制高脂血癥患者的血糖和血脂水平，有利于緩解機體的炎癥反應[19-20].Srebf1為胰島素抵抗通路中的調控基因，其轉錄活性的降低可抑制小鼠脂肪細胞的脂質異常堆積，增強小鼠對胰島素的敏感性[21].本研究結果表明，葛根素可通過影響Slc2a2、Haao和Cyp1a1等基因表達量改善小鼠的T2DM.

為了弄清基因-代謝物-腸道菌群對改善的T2DM的作用，對葛根素作用T2DM模型小鼠后的差異顯著的基因、代謝物和腸道菌群進行了整合分析.結果顯示，代謝物5-羥基-L-色氨酸和褪黑素含量的增加與unclassified_Rikenellaceae的豐度和Haao的表達量變化呈顯著正相關.Slc2a2、Haao和Cyp1a1的表達量與Parabacteroides的豐度變化呈顯著正相關，與Anaerotruncus的豐度變化呈顯著負相關.上述結果表明，基因、腸道菌群和代謝物之間密切關聯，葛根素可通過影響Slc2a2、Haao和Cyp1a1等基因表達量，改變unclassified_Rikenellaceae、Anaerotruncus和Parabacteroides等腸道菌群的豐度，調節5-羥基-L-色氨酸和褪黑素等代謝物的含量來改善小鼠T2DM.