病原菌感染斑馬魚胚胎差異表達基因的生物信息學分析研究

遲 彥， 彭程程， 郝予嘉， 郭瀚澤， 朱瑩瑩， 李佳芮

(1.遼寧師范大學 生命科學學院，遼寧 大連 116081；2.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622)

天然免疫又稱固有免疫，是物種在長期進化過程中逐漸形成的抵御病原菌感染的第一道防線，包括組織屏障、固有免疫細胞和固有免疫分子，它在抵御外來微生物侵擾和保護機體等方面發揮著非常重要的作用[1].天然免疫系統可以通過一系列的受體識別并監測病原菌的入侵，這一類受體被稱作模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRS)，包括Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)、RIG-1樣受體(RIG-I-like receptors，RLRs)、NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)和C型凝集素受體(C-type lectin receptors，CLRs)等亞家族，它們可以單獨或者共同協作發揮天然免疫功能.這些模式識別受體主要識別被稱為病原相關模式分子(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的病原菌微生物進化保守結構[2].參與天然免疫的模式識別受體識別病原相關模式分子后，激活細胞內信號通路[3]啟動促炎和抗菌反應,從而調節基因表達，最終啟動免疫應答.

斑馬魚的天然免疫系統在魚卵受精1～4 d就已發育成熟，而適應性免疫系統則在受精后的4～6周后才能發育成熟[4-5]， 即斑馬魚的胚胎發育過程中存在一個僅具有天然免疫的特殊時期[6].以斑馬魚為實驗材料可以排除適應性免疫的干擾，所以其在免疫學、發育生物學和病理學等方面的研究中具有非常重要的作用，成為研究人類相關疾病和在活體內進行早期藥物篩選、研究病原菌與宿主之間的相互作用及其免疫應答機制的模式生物.

本研究以斑馬魚胚胎感染遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的GEO表達譜數據庫(GSE35474)為分析對象，利用生物信息學手段分別篩選了兩種菌感染8 h后的差異表達基因，并通過GO功能富集和KEGG信號通路分析，對差異表達基因進行了功能注釋，獲得其相關的信號通路，并構建了差異表達基因蛋白質互作網絡(Protein protein interaction network，PPINetwork)，篩選了關鍵hub基因，為研究斑馬魚和病原菌之間的相互作用分子機制提供理論依據.

1 資料與方法

1.1 資 料

以斑馬魚和天然免疫為關鍵詞，在NCBI(National center of biotechnology information,NCBI)GEO(GeneExpression omnibus，GEO)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中進行搜索，選取斑馬魚分別受遲鈍愛德華氏菌和鼠傷寒沙門氏菌感染8 h之后的表達譜數據庫(GSE35474)進行后續生物信息學分析.

1.2 方 法

1.2.1 差異表達基因的獲取

將GEO數據庫中基因探針注釋為基因名后，利用R語言的“limma”包，對表達矩陣進行歸一化處理，以|lb FC|>0.2和校準后P<0.05為篩選條件，分別獲取遲鈍愛德華氏菌和鼠傷寒沙門氏菌感染斑馬魚胚胎的差異表達基因，利用TBtools軟件對上述兩組差異表達基因取交集，用于后續分析.

1.2.2 GO功能富集分析

利用DAVID 6.8在線工具(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)進行GO功能富集分析，將所得差異表達基因導入David網站，得出差異表達基因GO功能富集結果，該結果由生物學過程(Biological process，BP)、細胞組分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function,MF)3個方面組成.以P<0.05為篩選條件得到富集結果，利用R語言制圖.

1.2.3 KEGG信號通路分析

將差異表達基因導入DAVID 6.8在線分析網站(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)進行KEGG信號通路分析，將下載分析結果導出后，以P<0.05為篩選條件得到富集結果，利用R語言制圖.

1.2.4 構建差異表達基因間蛋白質-蛋白質相互作用關系圖

利用STRING網站(https://string-db.org/)分析所得差異表達基因間蛋白質的互相作用關系，在線構建蛋白質相互作用網絡.

1.2.5 篩選關鍵基因

利用Cytoscape 3.8.0軟件的cytoHubba插件，采用Degree、EPC、MNChe和Closeness 4種算法篩選關鍵hub基因.

2 結 果

2.1 差異表達基因的篩選

通過R語言“limma”包篩選得到鼠傷寒沙門氏菌感染斑馬魚胚胎差異表達基因2 366個，其中,上調表達基因1 141個，下調表達基因1 225個(圖1A).篩選得到遲鈍愛德華氏菌感染斑馬魚胚胎差異表達基因1 012個，其中,上調表達基因413個，下調表達基因599個(圖1B).對上述兩組差異表達基因取交集，最終得到127個共同差異表達的基因.

圖1A 鼠傷寒沙門氏菌感染斑馬魚胚胎差異表達基因的火山圖圖1B 遲鈍愛德華氏菌感染斑馬魚胚胎差異表達基因的火山圖Fig.1A Volcano map of differential expressed genes in zebrafish embryos infected with Salmonella typhimuriumFig.1B Volcano map of differential expressed genes in zebrafish embryos infected with Edwardsiella tarda

2.2 GO基因功能富集分析

將127個差異表達基因導入DAVID 6.8數據庫中進行分析，圖2顯示，127個差異表達基因一共參與38個生物學過程，6種細胞組成，11種分子功能.在生物學過程方面，19個基因參與了轉錄調控、DNA模板化過程，11個基因參與炎癥反應過程，9個基因參與天然免疫反應過程，9個基因參與了對細菌的防御反應.表1顯示的是以P<0.05篩選的排名前10的生物學過程.在細胞組成方面(表2)，25個基因參與組成細胞外區域和空間，21個基因參與組成細胞質，3個基因參與組成蛋白酶體復合物.在分子功能方面，差異表達基因主要富集在轉錄因子活性、序列特異性DNA結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性等功能，表3顯示的是以P<0.05篩選的排名前10的分子功能.

圖2 GO 基因功能富集分析Fig.2 GO gene functional enrichment analysis

表1 差異表達基因生物學過程分析

表2 差異表達基因細胞組成分析

表3 差異表達基因分子功能分析

2.3 KEGG信號通路分析

將127個差異表達基因導入DAVID 6.7數據庫中進行分析，以P<0.05為篩選標準，差異表達基因富集所在的信號通路排名前10的有Toll樣受體信號通路、JAK-STAT信號通道、MAPK信號通路、RIG-I樣信號通路、細胞凋亡信號通路、單純皰疹病毒感染信號通路等(圖3，表4).

圖3 差異表達基因KEGG信號通路分析結果Fig.3 Results of KEGG signaling pathway analysis of differential expressed genes

表4 差異表達基因KEGG信號通路分析結果

2.4 差異表達基因的蛋白質互作關系

將127個差異表達基因導入STRING在線網站進行差異表達基因的蛋白質與蛋白質相互作用分析，圖4顯示有106個節點，303個邊，平均節點度是5.72，平均局部聚類系數是0.363.

圖4 差異表達基因的蛋白-蛋白相關作用圖Fig.4 Protein-protein interactions network of differential expressed genes

2.5 關鍵hub基因篩選

利用Cytoscape 3.8.0軟件的cytoHubba插件，采用4種算法分別得到hub基因，最后將4種算法所得到的hub基因取交集，得到8個關鍵基因(圖5)，它們是TNFα、TNFβ、SOCS、IRF1、STAT3、MMP9、FOS、NF-κB.

圖5 4種算法的hub基因韋恩圖Fig.5 Hub gene Venn diagram of the four algorithms

3 Hub基因討論

3.1 TNF

TNF(Tumor necrosis factor，TNF)基因編碼腫瘤壞死因子.TNF家族主要包括TNFα和TNFβ.TNF可以通過結合腫瘤壞死因子受體發揮功能，參與多種生物學過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、脂質代謝和凝血，并與多種疾病有關，包括自身免疫性疾病、胰島素抵抗和癌癥等.Gali等以酵母β-葡聚糖作為免疫刺激劑刺激斑馬魚時發現，酵母β-葡聚糖使斑馬魚成纖維細胞高表達TNFα、IL1β、IL6、IL8、IL10等基因，即通過增強細胞因子的基因表達從而大大增加斑馬魚對鯉魚病毒感染的存活率[7].Wu等用創傷弧菌刺激3種轉基因斑馬魚品系，其中，轉羅非魚GRN-41肽的轉基因斑馬魚提高了TNFβ、IL1、IL8、IL6和HAMP的表達，進而提高了存活率[8].Li等用3種嗜球果傘素(吡咯菌酯，三氟木黃酮和微木黃酮)刺激斑馬魚胚胎，結果斑馬魚胚胎均可產生免疫反應，上調了TNFα、IL1β和IL8基因的表達[9].這些結果均提示TNF基因是與天然免疫相關的主要基因之一，其上調表達可啟動天然免疫反應.

3.2 SOCS

SOCS(Suppressor of cytokine signaling，SOCS)編碼細胞因子抑制劑家族成員，該基因的表達由多種細胞因子，如IL6、 IL10、IFNγ所誘導，其編碼的蛋白可以結合JAK2激酶進而抑制JAK2的活性.Xiao等發現鯉魚被SVCV(鯉魚春季血癥病毒)感染后，其腸、胸腺、脾臟、頭腎和腎臟組織中的SOCS3基因呈時間依賴性顯著上調，表明在病毒誘導的先天免疫應答的調節中SOCS3發揮積極作用，在病毒刺激下可以防止某些細胞因子的過度反應[10].Li等通過對太平洋牡蠣基因組的搜索和分析，確定了CgSOCS2、CgSOCS5和CgSOCS7三個SOCS基因，發現病原相關模式分子可以不同程度地誘導血細胞中CgSOCS(Crassostreagigassuppressor of cytokine signaling，CgSOCS)的表達.此外，雙熒光素酶報告基因分析結果顯示，CgSOCS2和CgSOCS7的過度表達可以激活NF-κB報告基因，這些結果表明CgSOCS可能在太平洋牡蠣的先天免疫應答中起重要作用[11].Zhang等用細菌病原體感染大菱鲆，發現SmSOCS3(Scophthalmus maximus suppressor of cytokine signaling 3，SmSOCS3)在大菱鲆腎臟、脾臟、肝臟和鰓中顯著表達.在頭腎巨噬細胞中，SmSOCS3的過表達表現為抑制TNFα和IL1β的轉錄，顯著降低了NO的產生和殺菌活性[12].

3.3 MMP9

MMP9(Matrix metalloproteinase 9，MMP9)是一種基質金屬蛋白酶，分泌時為無活性的前體蛋白，當被細胞外蛋白酶切割時會被激活，該蛋白酶在降解Ⅳ型和Ⅴ型膠原以及細胞外基質的局部蛋白水解、白細胞遷移中發揮作用.Soest等將愛德華氏菌靜脈注射斑馬魚胚胎，轉錄組和定量RT-PCR結果顯示斑馬魚胚胎表現出強烈的炎癥反應，IL1β和MMP9在全部胚胎中被誘導表達[13].Wang等利用愛德華氏菌浸沒感染斑馬魚幼蟲，發現炎性細胞因子TNFα、IL1β和MMP9等顯著上調[14].Shan等發現單核細胞增生性李斯特菌浸入斑馬魚中不會引起致死性，但會誘導一些免疫反應基因的表達，其中,MMP9表達量顯著上調[15].

3.4 IRF1

IRF1(Interferon regulation factor 1，IRF1)是干擾素調節因子(IRFs)家族一員，通過與啟動子中的干擾素刺激反應元件相結合，激活特定的靶基因而在病毒和細菌應答、細胞增殖、凋亡、DNA損傷修復以及免疫反應中發揮作用.

Ruan等在斑馬魚中發現IRF1B基因與哺乳動物IRF1基因同源[16].Fan等研究結果顯示當斑馬魚髓細胞內IRFγ信號通路異常激活時，STAT1A和IRF1B基因表達會明顯上調，影響了中性粒細胞發育，對天然免疫反應產生影響[17].Liu等以石斑魚為實驗對象發現DDX41(DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)-box Polypeptide 41)的同源基因EcDDX41(Epinepheluscoioides DDX41，EcDDX41)過表達導致了IRF1的表達上調[18].Feng等發現斑馬魚IRF1在斑馬魚的頭腎和脾臟等免疫組織中含量最豐富，是病毒感染后誘導作用最強的基因之一.在利用鯉魚病毒(SVCV)感染鯉魚上皮瘤細胞后，發現斑馬魚DrIRF1過表達，能夠誘導IFN和IFN刺激基因(Interferon-stimulated genes，ISGs)的表達，從而保護鯉魚上皮瘤細胞免受SVCV的侵襲，證明了DrIRF1是魚類抗病毒反應的正調節因子[19].上述實驗結果均可證明IRF1在天然免疫中起到重要作用.

3.5 STAT3

STAT3是信號轉導與轉錄活化因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT) 蛋白質家族的成員.STAT家族成員被受體相關激酶磷酸化，形成同源或異源二聚體移位入細胞核，作為轉錄激活因子介導應答各種細胞因子和生長因子,包括干擾素、EGF、IL5、IL6、HGF、LIF和BMP 2等的細胞刺激的基因表達，在細胞生長和凋亡過程中發揮重要作用.Liang等從日本鰻鱺中分離到兩個STAT家族基因(STAT1a和STAT2)，分別命名為AjSTAT1a和AjSTAT2.研究發現在感染遲鈍愛德華氏菌的組織中，AjSTAT1a和AjSTAT2基因表達增加，表明AjSTAT1a和AjSTAT2可能是調節宿主天然免疫防御病原體的關鍵[20].Xiong等在研究氧化石墨烯納米顆粒(Graphene oxide，GO)對斑馬魚肝臟毒性的影響實驗中發現，GO誘導成體斑馬魚肝臟NF-κBP65、JAK2、STAT3等基因表達顯著上調，天然免疫功能被激活，表明這些基因在調節天然免疫功能中起到重要作用[21].STAT3在免疫應答、信號轉導和轉錄調控中起到關鍵作用，是機體抵御病毒感染的重要靶基因.

3.6 NF-κB

NF-κB(Nuclear factor kappa B subunit，NF-κB)是幾乎所有細胞類型中都存在的多效轉錄因子，為一系列由生物學過程,如炎癥、免疫、分化、細胞生長、腫瘤發生以及凋亡等介導的信號轉導事件的終點.NF-κB由RELA/P65、RELB、NF-κB1/P105、NF-κB1/P50、REL和NF-κB2/P52組成同型或異型二聚體復合物.NF-κB復合物在細胞質中與I-kappa-B結合，為無活性狀態.當細胞轉導導致I-kappa-B磷酸化后，NF-κB則釋放入核，同DNA相應元件結合，調節基因表達，參與免疫、炎癥等反應.Oyarbide等利用鰻弧菌感染斑馬魚，通過基因表達分析，發現在感染后最初3 h內，許多先天免疫基因,如NF-κB、IL1β、TLR4和TRF的表達水平被抑制，由此表明，斑馬魚的免疫系統發生了變化[22].Goody等利用人甲型流感病毒(Human influenza A virus，IAV)感染杜氏肌營養不良的斑馬魚突變體，發現突變體斑馬魚肌肉中NF-κB信號被激活，斑馬魚的先天性免疫反應被激活，結果造成了更嚴重的肌肉損傷[23].

Zhang等利用副溶血性弧菌感染斑馬魚幼蟲，發現TNF信號通路、NF-κB信號通路和JAK-STAT信號通路有關的基因的表達均發生了改變[24].上述結果表明，NF-κB參與了斑馬魚的先天免疫反應.

3.7 FOS

FOS(Fos proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit)基因家族由4個成員組成：FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2.這些基因編碼亮氨酸拉鏈蛋白，能夠與Jun(Jun proto-oncogene，AP-1 transcription factor subunit)家族的蛋白質結合形成二聚體，從而形成轉錄因子復合物AP-1(Activator protein-1).因此，FOS蛋白被認為是細胞增殖、分化和轉化的調節因子.Yang等在利用從鼠傷寒沙門氏菌中提純的Pam3CSK4刺激斑馬魚胚胎，在qPCR分析中發現FOSB發生了2倍以上的變化，說明FOSB可能在斑馬魚胚胎的天然免疫過程在起到一定作用[25].Ellison等發現在病原菌攻擊下，低密度飼養的鮭魚表現出炎性白細胞介素和淋巴細胞相關基因的表達增加，而高密度飼養的鮭魚表現出與應激相關的標志物，如c-FOS和HSP70表達上調，說明c-FOS可能在調節天然免疫基因表達方面起作用[26].附表為文中提到基因的縮略詞表.

附表 縮略詞表