農藥代謝試驗放射性同位素示蹤樣品處理技術

李 政 余志揚 張素芬

（1浙江省農產品質量安全中心，浙江杭州 310003；2浙江大學原子核農業科學研究所，浙江杭州 310029）

農藥是人類確保糧食安全不可或缺的生產資料，也是確保“中國飯碗裝中國糧”必不可少的技術措施[1]。2017年我國頒布實施了新的《農藥登記資料要求》和《農作物中農藥代謝試驗準則》（NY/T 3096—2017）[2]，將基于放射性同位素示蹤技術的農藥代謝安全評價試驗作為登記資料要求之一。放射性同位素示蹤技術是利用放射性同位素標記的化合物研究物質運動過程及其規律的一種研究方法，具有溯源追蹤、痕量精準等特點，是目前國際公認的研究農藥代謝最有效的手段之一。在農藥代謝放射性同位素示蹤試驗中，科學選擇示蹤核素、規范引入示蹤劑、采取適宜方法凈化樣品等預處理技術，是準確鑒別代謝產物和定量分析的重要前提。

1 農藥代謝試驗常用放射性核素

利用放射性同位素示蹤技術開展農藥代謝研究，選擇適當的示蹤核素是保障試驗成功的關鍵。當選擇放射性示蹤核素時，應綜合考慮農藥分子本身結構、標記化合物合成難易及成本高低、測量儀器、實驗目的、試驗周期、人員安全防護等因素。目前，14C是農藥代謝試驗最常用的放射性示蹤核素，3H、32P和35S次之。這幾種核素使用較多主要有以下原因：一是在標記化合物合成過程中，絕大多數農藥的14C中間體容易得到，14C屬低能β放射核素，試驗放射性屏蔽、廢物處理和去污等方面要求簡便；14C半衰期為5 730年，物理半衰期長，無須作物理衰變校正。二是3H具有與14C相似的優點，半衰期為12.32年，但能量較低，需要特殊的測定條件[3]。三是32P和35S僅適于含P和S元素的農藥分子標記，標記化合物種類受限；32P、35S 半衰期分別為 14.26、87.48 d，試驗一般需要做物理衰變校正；32P能量較高，防護較14C困難。為確保試驗結果質量，對于一些結構復雜的農藥化合物，應選擇多位置標記和（或）雙（多）核素標記[4]。農藥標記化合物的化學純度和放射化學純度均應達到95%以上。

2 農藥代謝試驗供試作物選擇

據《農作物中農藥代謝試驗準則》（NY/T 3096—2017）要求，農藥登記代謝試驗供試作物分為5類，即根莖類作物、葉類作物、果實類作物、種子與油料類作物、谷類作物（表1）[2]，如登記作物不屬于此5類作物，可以向農藥登記管理部門具體咨詢。供試作物選擇原則：為了推斷一種農藥在所有作物種群中的代謝，應在上述5類作物中選擇3類，每類應至少選擇1種代表性作物進行代謝研究；在使用劑量和方法近似的情況下，每類中1種作物上的代謝數據可適用于同類其他作物；供試作物必須包含登記作物。

表1 用于農作物中農藥代謝試驗的作物與作物種類

3 示蹤劑引入方法

根據農藥代謝試驗目的、作物栽培方式、施藥方式等，應選擇易吸收、易操作的示蹤劑引入方法，引入劑量應準確，避免不必要的污染。常用示蹤劑引入方法有以下幾種。

3.1 示蹤劑莖葉引入方法

3.1.1 涂抹法。根據登記農藥劑型選擇適宜的助劑，將示蹤劑配制成適宜濃度的溶液，定量吸取示蹤劑溶液反復均勻涂抹至葉片或莖部表面，并通過測定實際引入作物的總放射性活度確定引入量[5]。處理葉的葉齡要求基本一致，涂抹時應防止葉面損傷和交叉污染。

3.1.2 噴霧法。用微型噴霧器將示蹤劑溶液均勻地噴灑在葉片表面，并通過測定實際引入作物的總放射性活度確定引入量。需要在氣密性良好的裝置中噴灑，以保證試驗人員安全，防止交叉污染。

3.1.3 濾紙黏附法。將濾紙剪成一定面積的小片貼在葉片上，用膠帶固定，反復用微量滴定管定量地將示蹤液滴到濾紙上，葉片從濾紙上吸收放射性示蹤液。通過測定實際引入作物的總放射性活度確定引入量。

3.2 示蹤劑基質引入方法

3.2.1 毒土法。用助劑將示蹤劑配制成適宜濃度的溶液，播種前均勻混入土壤，或播種后通過澆灌施入土壤。土壤引入主要適用于內吸性較強的農藥[6]。

3.2.2 砂培和水培法。用助劑將示蹤劑配制成適宜濃度的溶液，再將示蹤劑在預定時間（或作物生育期）加入培養液中。

3.3 示蹤劑種子引入方法

用助劑將示蹤劑配制成適宜濃度的溶液，按照農藥登記推薦施藥方式進行種子處理[7]。

4 農藥代謝試驗樣品制備技術

樣品制備是指將待測樣品處理成適合測定的檢測溶液的過程，主要包括提取、濃縮和凈化等3個部分內容。農藥登記代謝試驗的目的主要是農藥母體殘留分析、代謝產物溯源、組成甄別、分子結構鑒定等。樣品測定分析時通常需要將放射性測量技術與高效液相色譜、高分辨質譜聯用，因而選擇合適的樣品制備方法至關重要。

4.1 提取

4.1.1 提取劑選擇。根據“相似相溶”原理，提取劑應選擇與殘留農藥理化性質相似的溶劑，沸點宜為45～80℃，要求其既能溶解待測農藥，又不與待測農藥反應。當樣本含水量較高時，通常選用能與水互溶的極性溶劑，如丙酮、乙腈等[8]；如果提取的是非極性農藥，可在極性溶劑中加入適量的非極性溶劑。溶劑的極性強弱通常用其從氧化鋁吸附劑上洗脫一系列供試溶質的能力（洗脫能力參數）來表示（表2），參數越大洗脫能力越強，說明溶劑的極性越強。

表2 氧化鋁吸附柱中溶劑的洗脫能力

4.1.2 常用提取方法。提取試劑選擇后，根據樣品的形態特點常選擇以下方法進行提取。

（1）液-固提取法（liquid-solid extraction，LSE）。液-固提取法主要包括2個同時進行的過程，即固體樣品中的欲測定組分分子在溶劑中溶解過程和欲測定組分分子與溶劑分子相互擴散的過程。將固體樣品研磨后放入提取試劑中，選擇合適的轉速振蕩提取，必要時可以加熱，然后利用離心、過濾的方法使液與固分離，農藥母體及代謝產物組分進入溶劑。2017年張金娥等[9]利用LSE法分析了水果、蔬菜中20種有機氯和擬除蟲菊酯類農藥殘留量。

（2）加速溶劑萃取法（accelerated solvent extraction，ASE）。采用常規溶劑，在較高的溫度（50～200 ℃）和壓力（10.3～20.6 MPa）條件下對固體或半固體樣品進行萃取。此法需要使用加速溶劑萃取儀，提取時應選擇合適容積的萃取池，底部加纖維濾紙膜，然后將樣品裝入萃取池中，裝好的萃取池放到萃取池托架上，下方對應放一個收集瓶。儀器啟動后，自動將萃取池送入加熱爐、向萃取池加注溶劑至指定壓力并加熱至設定溫度。樣品在高溫高壓條件下靜態萃取一定時間后，將萃取池中的提取液釋放到收集瓶中，再向萃取池內注入新溶劑，進行下一個靜態萃取循環，直到完成設定的循環次數。之后用一定體積的新溶劑沖洗萃取池，最后用氮氣將剩余的溶劑吹入收集瓶，以保證萃取液被全部收集。加速溶劑每提取10 g樣品約需溶劑15 mL，每個樣品的提取時間一般少于20 min。2019年焦慧澤等[10]用加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定茶葉中10種擬除蟲菊酯類農藥殘留，添加回收率為68.7%～103.8%，RSD為0.8%～13.2%。

（3）微波輔助萃取法（micro-wave-assisted extraction，MAE）。提取時使用微波進行加熱，極性溶劑分子可以迅速吸收微波能量使萃取罐內處于高溫高壓的狀態，有利于快速將殘留農藥從樣品中提取出來。此方法具有高效、安全、試劑用量小和易于自動化等特點，是美國EPA推薦的樣品預處理方法之一。2019年劉培勇等[11]用微波輔助提取-分散固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法分析了果蔬中20種農藥的殘留，該方法添加回收率為64.5%～121.0%。

（4）基質固相分散萃取法（matrix solid phase dispersion，MSPD）。基質固相分散萃取技術是由Barker等在1989年首次提出，其原理是將涂有C18色譜柱等多種聚合物的單體固相萃取材料與樣品一起研磨，得到半干狀態的混合物并將其作為填料裝柱，然后選用不同的溶劑淋洗柱子，將相應待測物洗脫下來。該方法融合了傳統的樣品提取、凈化等過程，適用于不同極性農藥殘留的提取凈化，具有快速、價廉和試劑用量少等優點。2017年秦偉瀚等[12]利用該方法同時檢測13種不同產地昆明山海棠中有機磷和擬除蟲菊酯類農藥殘留情況。結果表明，與藥典方法和文獻方法相比，該方法具有簡單快速、節本高效等優點。

（5）QuEChERS法。2003年，美國農業部開發出一種新的樣品前處理方法，即QuEChERS法。該方法具有快速、簡便、低廉、高效、穩定和安全等優點。常規QuEChERS法具體步驟：稱取10 g樣品于塑料離心管中，加入10 mL乙腈振蕩1 min后，再加入4 g無水硫酸鎂和1 g醋酸鈉，將離心管密封、振蕩、離心，取上層清液1 mL于小離心管中，加入150 mg無水硫酸鎂和25 mg PSA（N-丙基乙二胺）振蕩、離心，用一次性注射器取上層清液過有機濾膜后待檢[13]。在上述方法中，對于成分復雜、干擾物質多的植物性樣品，還需酌情加入石墨化炭黑GCB（graphitised carbon black，GCB）和C18。其中，無水硫酸鎂去除有機相中的水分；PSA吸附基質中碳水化合物、酚類、各種極性有機酸、少量色素、糖類和脂肪酸；GCB去除基質中的色素、甾醇類和非極性干擾物；C18去除脂肪酸、脂類等非極性干擾物[14]。該方法同時融合了提取、凈化等過程，操作簡單，回收率較高。2020年楊志敏等[15]采用改良QuEChERS法建立了同時檢測枸杞干果中118種農藥殘留的氣相色譜-質譜分析方法。

4.2 濃縮

基質固相分散萃取法、QuEChERS法等方法樣品和試劑用量較少，濃縮過程可以酌情處理。但是，常規溶劑提取法所用溶劑量相對較大，樣品中農藥殘留量一般較低，在凈化和檢測前必須對提取溶液進行濃縮。常用的濃縮方法有旋轉蒸發法和氮氣吹干法等。

4.2.1 旋轉蒸發法。利用旋轉蒸發儀來完成濃縮，通過減壓降低溶劑沸點，并利用旋轉濃縮瓶對濃縮液進行攪拌，在瓶壁上形成液膜、擴大蒸發面積，從而達到濃縮效果。旋轉蒸發法具有濃縮速度快、農藥損失小、溶劑可回收等優點，特別適合大體積樣品提取液的濃縮，但需要二次轉移，不宜用于高度濃縮。

4.2.2 氮氣吹干法。利用氮氣流輕緩吹拂提取液，以加速溶劑的蒸發。為了加速溶劑的濃縮，常常在吹氣的同時用水浴適當加熱。該方法為實驗室常用的濃縮方法之一，一般適用于少量溶劑的濃縮，蒸氣壓高的農藥因容易損失而不宜采用。

4.3 凈化

當用有機試劑提取樣品中的殘留農藥時，會同時帶入脂肪、色素、蠟質等雜質，影響定性定量測量和儀器使用壽命。凈化主要利用殘留農藥與干擾雜質理化性質的差異，將干擾物數量減少到不影響正常檢測的水平。

4.3.1 柱層析法（column chromatography）。柱層析法又稱吸附色譜法，是普遍應用的傳統凈化方法之一。該方法將提取液中的農藥與雜質一起通過一根裝有適宜填料的柱子，使它們吸附在柱子上，然后用適當極性的溶劑淋洗，農藥一般先被洗脫下來，而色素、蠟質、脂肪等雜質留在吸附柱上，從而達到純化的目的。根據雜質種類和性質的不同，常用的柱填料有硅鎂吸附劑/弗羅里硅土、氧化鋁、活性炭和硅膠等。2020年童紅梅等[16]研究表明，柱層析法工藝流程更簡單，去除色素類雜質效果較好。

4.3.2 固相萃取法（solid phase extraction，SPE）。固相萃取是由液固萃取和柱層析技術相結合而發展起來的一種預處理技術，固相萃取過程實質上就是一個柱色譜分離過程。SPE利用選擇性吸附與選擇性洗脫的液相色譜法分離原理，對樣品進行富集、分離、凈化，克服了傳統液液萃取技術難以處理大體積樣品和萃取過程容易乳化等缺點。SFE與柱層析相似，但因萃取柱商品化，萃取效果較柱層析好。2021年王燕等[17]用固相萃取-氣相色譜質譜法同時測定環境水體中79種半揮發性有機污染物，平均回收率為60.6%～137.3%，相對標準偏差（RSD）為 0.8%～8.8%。

4.3.3 固相微萃取法（solid phase microextraction，SPME）。SPME裝置主要由萃取手柄、萃取頭和專用萃取平臺等3個部分組成。萃取頭是一根長1 cm、表面涂有吸附聚合物的熔融石英纖維絲，固定在不銹鋼活塞上，活塞安裝在萃取手柄上。萃取樣品時，先將萃取頭從手柄內推出，然后將其浸漬在樣品溶液中或置于樣品上空，有機物會吸附在萃取頭上。吸附一段時間后，把萃取頭收縮至鞘內，抽出萃取頭，即可與檢測儀器聯機進行分析。2021年Lee等[18]通過頂空固相微萃取氣相色譜-質譜法鑒定出了某種植物的66種揮發性成分。2021年Belinato等[19]采用基質兼容纖維全自動固相微萃取法測定蜂蜜中擬除蟲菊酯類殺蟲劑，較好地克服了基質影響。

5 結語

在研究農藥代謝的放射性同位素示蹤試驗過程中，采用液體閃爍計數法進行放射性同位素測量時難免存在淬滅效應，影響測量精度，而樣品提取過程中的色素、蠟質、脂肪、碳氫化合物等雜質是引起顏色淬滅、化學淬滅的主要原因。同時，在放射性同位素樣品分析測試過程中不可避免地產生廢氣、廢液和固體廢物等放射性廢物，試劑和樣品用量越少越有利于放射性廢物的處理。在實際工作中，需要根據農藥本身性質、樣品種類、基質組分和檢測方法等不同特點，科學選擇標記核素、示蹤劑引入方式，合理選擇樣品前處理方法，確保檢測結果準確性，降低放射性廢物處理成本。