漢麻內生菌的分離及其抑菌活性研究

吳 瓊 王 雷 曹滌非 李 瑤 孫 堯 孫 鑫 薛佳瑩 黃國慶

（黑龍江省科學院高技術研究院，黑龍江哈爾濱 150020）

宿主植物種類及外在環境不同，植物內生菌種類和數量存在很大差異，因而內生菌菌種多種多樣[1-2]。從漢麻中可以篩選出具有抑菌活性的內生菌，其會產生抗生素等活性成分，并且為了避免宿主植株死亡，這些抗生素活性成分毒性相對較低[3]。因此，開發漢麻內生菌，尋找新的抗生素，具有廣闊的研究前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗試劑包括牛肉膏蛋白胨培養基；PDA培養基，由北京奧博星生物技術有限責任公司生產；瓊脂粉。

試驗設備包括恒溫培養箱、全自動立式高壓滅菌器。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集。選擇茂盛、無病蟲害的漢麻植株，采集其新鮮的葉片、根、莖，每株采集3～4片葉片（無病蟲害及斑點）。

1.2.2 樣品預處理。采集得到的新鮮漢麻葉片用清水漂洗后切成0.3 cm×0.3 cm的組織塊，將根、莖切成0.3 cm長的組織塊，對組織塊進行表面處理、表面干燥。

1.2.3 樣品表面消毒。對預處理得到的樣品進行表面消毒，方法如下：0.1%升汞漂洗10～30 s→無菌水沖洗數次→75%乙醇漂洗30～60 s→無菌水沖洗數次。檢測表面消毒有效性：本試驗需對檢驗材料組織表面消毒是否全面進行檢測，設置2組對照試驗。第1組：表面消毒完畢后，取最后一次清洗漢麻樣品的無菌水涂布于平板培養基上，設置3個平行。第2組：將消毒后的漢麻樣品置于平板培養基上，與培養基表面接觸幾分鐘后取出，設置3個平行。將2組平板倒置于恒溫培養箱（相同條件）中培養3 d，觀察平板中是否長菌。無菌說明消毒徹底；有菌則表明消毒不徹底，需要重新進行樣品預處理、表面消毒用于內生菌分離純化。

1.2.4 漢麻內生菌分離純化。在無菌操作條件下將組織塊接種到PDA培養基中進行組織培養，每個平板接種4～5個組織塊，共接種6個平板。將平板分成2組分別置于28℃及37℃恒溫培養箱中培養3～7 d。觀察到組織塊長出菌落后，使用接種環挑取不同的菌落，采用劃線法將菌落接種于平板培養基中進行分離培養。反復接種2～3次后，挑取單菌落的菌絲體在顯微鏡下觀察，如無雜菌即可確定為純種菌株。得到的純種菌株分類接種于PDA斜面培養基中編號保藏。

1.2.5 漢麻內生菌發酵液上清液抑菌活性測定。菌株培養條件：溫度設置為30℃，搖床轉速150 r/min，用100 mL三角瓶裝液30 mL，培養基的初始pH值設定為7.2。對發酵液上清液的抑菌活性進行測定采用的是菌絲平板生長抑制法[4-6]，方法如下：在無菌條件下操作，吸取2.5 mL菌株發酵液上清液置于培養皿中，取12.5 mL融化后冷卻至40℃左右的PDA培養基加入培養皿中，混合均勻制成平板。對照以無菌水代替發酵液上清液。試驗組及對照組均設3次重復。將供試病原菌菌絲塊接入平板中央，30℃恒溫培養。觀察到對照培養皿中病原菌菌絲長滿平板時，采用十字交叉法，用游標卡尺測量每個培養皿的病原菌菌落直徑，計算抑菌率。計算方法如下：

抑菌率（%）=（對照菌落直徑－樣品菌落直徑）/對照菌落直徑×100

2 結果與分析

2.1 漢麻不同部位菌株種類

由表1可知，在64株漢麻內生菌中，15株來自漢麻根段、16株來自漢麻莖段、33株來自漢麻葉。結果表明，漢麻葉中的內生菌資源較豐富。

表1 漢麻不同部位內生菌分布情況

2.2 漢麻內生細菌對病原菌的抑制率

對17株漢麻內生細菌（3株來自漢麻根段、5株來自漢麻莖段、9株來自漢麻葉）的發酵液上清液進行抑菌活性檢測，檢測到8株有抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑制率不同（表2）。由表2可知，漢麻內生細菌中有抑菌活性的菌株比例較高且抑菌譜較廣，對于供試細菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等均表現出一定的抑制作用。在8株有抑菌活性的漢麻內生細菌中，有6株來自漢麻葉片。

表2 漢麻內生細菌對3種病原菌抑菌效果

3 結論

結果表明，從漢麻中分離得到64株內生菌，其中15株來自漢麻根段、16株來自漢麻莖段、33株來自漢麻葉，漢麻葉中的內生菌資源較豐富。漢麻內生細菌中有抑菌活性的菌株比例較高且抑菌譜較廣，對于供試細菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等均表現出一定的抑制作用。