脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對大鼠缺血/再灌注損傷心肌的作用及Wnt3a/β-catenin 信號通路的影響

陳曉佳 郭子傲 郭金華 李林科 張劍凱 楊 春 崔曉軍

廣東醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣東東莞 523808

近年來動脈粥樣硬化性心血管病（arteriosclerotic cardiovascular disease，ASCVD）發(fā)病率逐年上升，ASCVD 指動脈粥樣硬化斑塊堵塞血管導(dǎo)致缺血梗死，發(fā)病急，死亡率高[1]。得益于經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）的發(fā)展和普及，堵塞的冠狀動脈可及時復(fù)通，病死率下降明顯，但冠狀動脈復(fù)通引起的心肌缺血/再灌注后損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）可影響PCI 的療效和預(yù)后，如何有效保護和防治MIRI 成為臨床上亟待解決的重要問題之一[2-4]。有研究顯示[5]，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（adipose mesenchymal stem cell-exosomes，ADMSC-exs）可通過抗細(xì)胞凋亡和促進血管生成來預(yù)防MIRI[6-7]，然而其對MIRI 預(yù)防機制尚不清楚，故本研究在前期細(xì)胞實驗的基礎(chǔ)上[8]，通過建立I/R 動物模型，研究ADMSC-exs 對MIRI 的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年SD 大鼠[合格證、生產(chǎn)許可號：No440021000 300001、SCXK（粵）2016-0041]，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗操作均符合倫理要求。

1.2 試劑與藥品

戊巴比妥鈉（德國默克公司，批號：1703163）；酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（美國Bio Vision 公司，批號：P170550、P181120、P161008）；TUNE熒光試劑盒（塞維爾生物技術(shù)有限公司，批號：GB17002）；一抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）（美國Abnova 公司，批號：AB18455、AB16321）；一抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific protease，caspase-3）、Wnt3a、β-catenin（美國Novus Biologicals公 司，批 號：NB10056708、NB10056708、5036 WN010、NBP154467SS）；二抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：J20170810）；Wnt3a/β-catenin 抑制劑XAV939（BioVision 公司，批號：P160616）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及給藥 40 只成年SD 大鼠，隨機原則，制作隨機數(shù)字表，分為S 組[假手術(shù)組，只開胸不結(jié)扎冠狀動脈左前降支（left anterior descending，LAD）]、I/R 組（結(jié)扎LAD 30 min后再灌注）、Ex 組（結(jié)扎LAD 30 min 后再灌注，再灌注5 min 內(nèi)尾靜脈注射ADMSC-exs）、Ex+X 組（結(jié)扎LAD 30 min 后再灌注，再灌注5 min 內(nèi)從尾靜脈注射ADMSC-exs 和XAV939）。每組10 只。每只鼠的給藥量為200 μl 含400 μg ADMSC-exs；Ex+X 組每只鼠給藥量為200 μl 含400 μg ADMSC-exs 和10 μmol/L XAV939。

1.3.2 血清心肌酶檢測 再灌注4 h 后，取2 ml 全血，4500 r/min 離心10 min，離心半徑16 cm，取血清，檢測CK-MB、LDH 和cTnI 的水平。

1.3.3 心肌細(xì)胞凋亡評估 再灌注4 h 后，取心臟，制作冰凍切片，切片PBS 溶液清洗3 次，加入含0.1%Triton X-100 的PBS，冰上孵育2 min，切片上滴加50 μl TUNEL 檢測液，37℃避光孵育60 min。PBS 洗滌3 次，封片后熒光顯微鏡下觀察。心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）=平均光密度×（凋亡陽性細(xì)胞數(shù)/總心肌組織細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.3.4 凋亡相關(guān)蛋白和Wnt3a/β-catenin 信號檢測取心臟，RIPA 裂解，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉孵育，在4℃下加入一抗抗體Bcl-2（1∶2000）、Bax（1∶2000）、caspase-3（1∶4000）、Wnt3a（1∶2000）、β-catenin（1∶3000）和β-actin（1∶1000）搖床孵膜8 h。辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG 或羊抗鼠IgG 二抗孵育4 h，曝光儀顯影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌酶水平比較

I/R 組LDH、CK-MB、cTnI 水平高于S 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。Ex 組心肌酶水平低于I/R 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。當(dāng)尾靜脈注射Wnt3a/β-catenin 通路抑制劑XAV939 后，Ex+X 組心肌酶水平高于S 組和Ex 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；與I/R 組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 各組心肌酶水平比較（）

表1 各組心肌酶水平比較（）

注：與S 組比較，aP ＜0.05；與I/R 組比較，bP ＜0.05；與Ex 組比較，cP ＜0.05。LDH：乳酸脫氫酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶；cTnI：肌鈣蛋白I

2.2 各組AI 比較

I/R 組AI 高于S 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。給予ADMSCs-ex 治療后，Ex 組AI 低于I/R 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。Ex+X 組AI 高于Ex 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組AI 比較（%，）

表2 各組AI 比較（%，）

注：與S 組比較，aP ＜0.05；與I/R 組比較，bP ＜0.05；與Ex 組比較，cP ＜0.05。AI：凋亡指數(shù)

2.3 各組凋亡相關(guān)蛋白和Wnt/β-catenin 信號檢測比較

I/R 組Bcl2/Bax、Wnt3a、β-catenin 水平低于S組，caspase-3 水平高于S 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。Ex 組Bcl2/Bax、Wnt3a、β-catenin 水平高于I/R 組，caspase-3 水平低于S 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。Ex+X 組Bcl2/Bax、Wnt3a、β-catenin 水平低于S 組，caspase-3 水平高于Ex 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 各組凋亡相關(guān)蛋白和Wnt3a/β-catenin 信號檢測比較（）

表3 各組凋亡相關(guān)蛋白和Wnt3a/β-catenin 信號檢測比較（）

注：與S 組比較，aP ＜0.05；與I/R 組比較，bP ＜0.05；與Ex 組比較，cP ＜0.05。Bcl2/Bax：抗B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因/Bcl-2 相關(guān)X 蛋白；caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

3 討論

由ASCVD 導(dǎo)致的心肌梗死是臨床常見的急危重癥，雖然PCI 可降低死亡率，但冠狀動脈I/R 后導(dǎo)致的二次打擊MIRI 仍是影響患者康復(fù)和預(yù)后的潛在危險。再灌注后引起的心肌細(xì)胞微環(huán)境改變導(dǎo)致心肌死亡可影響患者心功能恢復(fù)，甚至誘發(fā)心力衰竭[9]，故在進行PCI 的前后預(yù)防和治療MIRI 可明顯提高和鞏固PCI 的治療效果[10]。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有的多譜系分化優(yōu)勢，可用于組織再生修復(fù)，研究發(fā)現(xiàn)[11]，MSC 可為受損心肌組織提供有利于再生和修復(fù)的微環(huán)境。因為體外培養(yǎng)的MSC 免疫原性增強，移植后歸巢率低，潛在的癌變風(fēng)險等因素，限制了MSC 直接體內(nèi)移植的應(yīng)用，所以MSC 的旁分泌因子越來越受到重視[12]。外泌體是一種直徑30～100 nm 的脂質(zhì)雙層細(xì)胞外囊泡，可攜帶遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)在細(xì)胞間傳遞[13]。據(jù)報道，MSCs 外泌體有保護受損心肌細(xì)胞的功能，本課題組前期細(xì)胞實驗已證實了ADMSC-exs 可通過預(yù)防和保護MIRI[8]。

CK-MB、LDH 和cTnI 可用于評估和預(yù)測心肌梗死的嚴(yán)重程度[14-15]，實驗結(jié)果顯示，I/R 組血清心肌酶量升高，提示I/R 模型建立成功。Ex 組血清中心肌酶水平較I/R 組下降，提示ADMSC-exs 可保護受損的心肌細(xì)胞。

MIRI 發(fā)生時，心肌微環(huán)境改變可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]，MSCs 外泌體能阻止心肌梗塞后缺血心肌處的心肌細(xì)胞凋亡[17]。TUNEL 檢測結(jié)果顯示，I/R 組AI 較其他三組明顯升高，Ex 組AI 明顯低于I/R 組，提示ADMSCexs 可預(yù)防受損的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bcl-2、Bax、caspase-3 與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Bcl-2、Bax 是凋亡的“分子開關(guān)”，當(dāng)Bcl-2 表達量高于Bax 時，可抑制細(xì)胞凋亡，抑制caspase-3 的表達亦可阻止細(xì)胞凋亡[18-20]。過表達的Bax 可在線粒體膜上形成同源二聚體，增加線粒體膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞色素C 外流，觸發(fā)凋亡執(zhí)行者caspase-3 活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21-22]。Bcl-2 可與Bax 形成異源二聚體阻止Bax 的促凋亡效應(yīng)[23]。進一步檢測各組Bcl-2/Bax 顯示，Ex 組Bcl-2/Bax 比值明顯高于I/R 組，且Ex 組caspase-3 表達量明顯低于I/R 組。據(jù)此可推測，ADMSC-exs 可通過調(diào)控Bcl-2與Bax 相對表達量抑制受損的心肌凋亡，進而保護心臟。

Wnt3a/β-catenin 信號通路參與調(diào)控細(xì)胞的凋亡和增殖，Wnt3a 表達量升高，可增加細(xì)胞內(nèi)β-catenin 的量，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，XAV939 是Wnt3a/β-catenin信號通路的特異性抑制劑，可阻斷Wnt3a/β-catenin信號通路對下游基因的調(diào)控[24-25]。實驗結(jié)果顯示，給予XAV939 抑制劑的Ex+X 組中，心肌酶、AI 均明顯升高，接近I/R 組水平，ADMSCs-exs 保護受損心肌的作用消失，Ex+X 組Bcl-2/Bax、caspase-3 表達量低于Ex組，抵消了ADMSCs-exs 對心肌的保護作用。

綜上所述，ADMSC-exs 對大鼠I/R 損傷心肌具有保護作用，其作用機制與Wnt3a/β-catenin 信號通路有關(guān)。