基于免疫基因的膠質母細胞瘤預后預測模型的構建和驗證

潘強，程偉進，陳建軍，盧曄芬

膠質母細胞瘤（GBM）是常見的一種極具侵襲性的顱內惡性腫瘤[1]，1 年生存率約為25%，2 年生存率不到5%[2]。多組學研究表明，GBM是一種在分子水平和臨床上異質性明顯的疾病。癌癥基因組圖譜計劃（TCGA）于2010年構建了類似的GBM 分型系統(tǒng)，基于對轉錄組數(shù)據(jù)的無監(jiān)督聚類，將GBM 分為經(jīng)典型、神經(jīng)原型、神經(jīng)型和間充質型，其中間充質型GBM 的預后最差，復發(fā)率和病死率最高[3]。腫瘤微環(huán)境（TME）廣泛參與癌癥的發(fā)生發(fā)展等過程，TME的免疫細胞組成常常決定其對治療的響應，而GBM 的TME 處于明顯的免疫抑制狀態(tài)[4]。因此，有必要對GBM 腫瘤異質性特征整合TME進行研究，以期從新的視角對GBM進行風險評估和靶向治療。本研究基于GBM 的分子亞型和免疫標志基因，通過網(wǎng)絡分析，構建基于免疫基因的GBM預后模型（IPSGBM），結合免疫特征基因和腫瘤異質性，納入不同亞型進行風險評估，現(xiàn)將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)準備和預處理 本研究納入3個獨立數(shù)據(jù)集，共包含1 067 例GBM患者。選取中國膠質母細胞瘤基因組圖譜（CGGA）中的388 例GBM患者RNA測序數(shù)據(jù)作為訓練隊列，TCGA（HGUG133A）（525 例），GEO（Genome Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中的GSE16011（154 例）作為驗證隊列。從GlioVis（http://gliovis.bioinfo.cnio.es/）數(shù)據(jù)庫獲取GBM 患者的標準化表達數(shù)據(jù)及相應的臨床和分子分型信息，見表1。

表1 隊列的臨床資料

1.2 整合網(wǎng)絡分析 從Immport 數(shù)據(jù)庫獲取免疫基因列表。使用“RTN”包構建免疫基因和靶基因間的調控網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)與非間充質型GBM 相比，有34 個免疫基因（|log2 FC|＞1.5，BH-adjusted P＜0.05）和726 個靶基因（log2 FC＞0.75，BH-adjusted P＜0.01）在間充質型GBM 中差異表達。借助主調控分析（MRA）方法，通過超幾何檢驗測定了每個免疫基因調控單元中上皮間充質轉化（EMT）相關基因的表達情況。

1.3 構建和驗證基于免疫基因的GBM預后模型 通過MRA 篩選出的免疫基因為間充質型GBM 的關鍵調控因子。結合這些免疫基因的表達情況和患者總體生存期，通過Cox 比例風險回歸分析構建了一種基于免疫基因的GBM 預后模型（IPSGBM），并對CGGA 隊列中的患者進行風險賦分，以平均值為界將患者分為高風險組和低風險組。該模型的計分方程：風險評分=（0.060 8×STC1）+（0.011 2×PLAU）+（0.000 3×PLAUR）。隨后，通過Kaplan-Meier 分析在其他兩個獨立數(shù)據(jù)集中檢驗IPSGBM的預測效能。

1.4 功能分析 為比較不同風險組間的免疫生物學差異，從MSigDB 數(shù)據(jù)庫下載獲取kegg基因集，設定運行參數(shù)為1 000 次隨機排列，P＜0.05，使用“fgsea”R包進行基因集富集分析（GSEA）。

1.5 統(tǒng)計方法 采用R 統(tǒng)計軟件進行分析。使用“l(fā)imma”包完成差異基因分析，比較間充質型GBM 和非間充質型GBM 間差異表達的免疫基因和相應的靶基因；使用“survivla”包采用對數(shù)秩檢驗方法，通過Kaplan-Meier 分析比較高風險組和低風險組間的生存差異；相關性使用Pearson 相關分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 整合網(wǎng)絡分析 經(jīng)過MRA，確定STC1、PLAU 和PLAUR 3 個免疫特征基因為間充質型GBM 的主調控基因。相關分析發(fā)現(xiàn)STC1、PLAU 和PLAUR基因和上皮間充質轉化通路中的關鍵基因TGFB1 有關（r=0.36、0.59、0.59，均P＜0.05），見彩圖3。

圖3 STC1、PLAU 和PLAUR 免疫特征基因與TGFB1 的相關分析

2.2 IPSGBM 的構建和評估 依據(jù)IPSGBM 的賦分方程，計算了CGGA 隊列和驗證隊列中患者的風險評分。在每個隊列中，以風險評分的平均數(shù)為閾值，將患者分為高危組和低危組。在CGGA隊列和驗證隊列中，高危組的總體生存期低于低危組（風險比=1.36、1.42、1.55，均P＜0.05），見彩圖4。

圖4 不同風險組的生存差異

2.3 功能分析 GSEA結果顯示，TGF-、EMT、黏著斑激酶等信號通路在高危組中顯著上調，見彩圖5。

圖5 集富集分析結果

3 討論

GBM 是一種難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，極具侵襲性且預后較差，中位生存期僅15 個月[5]。GBM 可分為4 種分子亞型（神經(jīng)原型、神經(jīng)型、經(jīng)典型和間充質型），其中間充質型GBM 富含巨噬細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞，炎癥反應活躍，與其他亞型相比，臨床預后最差[3]。大量證據(jù)表明，免疫特征基因可作為評估患者臨床轉歸和治療反應的生物標志物[6-8]。本研究通過整合間充質亞型GBM 的免疫特征基因和分子模式進行網(wǎng)絡分析，構建基于免疫基因的GBM 預后模型。

本研究發(fā)現(xiàn)間充質型GBM 的3 個主調控免疫基因（STC1、PLAU、PLAUR），單個基因即有較好的預后預測價值。這3 個基因廣泛參與免疫應答，如STC1 涉及TME 的調節(jié)，在肺腺癌中腫瘤相關成纖維細胞表達的STC1 產物調控腫瘤相關巨噬細胞的分化[9]。有研究表明，在食道鱗狀細胞癌[10]、結直腸癌[11]及肝細胞癌[12]中STC1 高表達水平與患者較差的生存期相關。據(jù)報道，PLAU 抑制輔助性T細胞[13]，且在腫瘤轉移中發(fā)揮重要作用[14]，PLAU高表達與肺鱗癌較差的預后相關[15]。PLAUR 影響腫瘤細胞的增殖和侵襲，是惡性腫瘤預后的不良因素[16]。

IPSGBM 是一種可靠的GBM 預后模型，由此定義的低危組患者相對高危組患者總體生存率顯著改善。本研究GSEA 結果發(fā)現(xiàn)，在高危組中間充質特征相關的如TGF、EMT、黏著斑等信號通路顯著上調。

盡管構建的IPSGBM 能在GBM 患者預后預測中發(fā)揮較好作用，但本研究尚存一些局限性。首先，本研究是一項回顧性分析，納入的數(shù)據(jù)集來源于公共數(shù)據(jù)庫中高通量測序產生的轉錄組數(shù)據(jù)，價測序費用昂貴、數(shù)據(jù)前處理繁瑣，不利于其在臨床一線的推廣應用，而隊列中的某些患者可能罹患基礎性疾病、急慢性感染或服用抗炎藥物，對研究產生干擾，因此有待更多的前瞻性隊列驗證。其次，本研究中的所有數(shù)據(jù)集都來自單個測序平臺，提出的IPSGBM 是否也適用于其他測序平臺解析出的表達譜數(shù)據(jù)仍未清楚。最后，需要設立統(tǒng)一的風險閾值以促進該模型的臨床應用。未來需要納入多中心的臨床樣本，進一步探究該模型的內在生物學功能。