莖瘤芥BjuGAPC基因序列特征及其參與莖發(fā)育的糖酸含量調(diào)控

李曉燕， 李成雙， 金業(yè)程， 魏小涵， 李夢瑤

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，四川成都611130)

莖瘤芥(Brassicajunceavar.tumidaTsen et Lee)屬于十字花科，是蕓薹屬芥菜種的變種之一，也是榨菜生產(chǎn)的主要原料[1]。莖瘤芥的產(chǎn)品器官為膨大的瘤狀莖，既可鮮食，又宜加工，具有極高的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值。莖瘤芥的生長和發(fā)育過程受到外部條件、內(nèi)源激素等共同調(diào)控[2-3]。已有研究結(jié)果證明，許多關(guān)鍵基因可以調(diào)控果實發(fā)育過程中有機酸和糖代謝的合成[4]，但在莖瘤芥莖膨大過程中有關(guān)糖酸含量的調(diào)控基因以及關(guān)鍵基因的生物信息分析較少。因此，結(jié)合莖瘤芥莖膨大過程中糖酸含量的變化，克隆與之相關(guān)的基因并研究其表達模式與調(diào)控作用，能夠給莖瘤芥的分子育種和改良莖瘤芥品種提供一定的理論依據(jù)。

在植物體內(nèi)，糖不僅是能量代謝的物質(zhì)來源，同時可調(diào)控植物生長發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答[5]。果蔬及其制品中糖和有機酸的種類、數(shù)量以及糖酸比會影響其風(fēng)味品質(zhì)。可溶性糖是淀粉合成的底物，也直接關(guān)系到變態(tài)莖的營養(yǎng)狀況，還原糖是蔗糖、淀粉等合成過程中光合作用的必需物質(zhì)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是高等植物糖酵解和糖異生反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，大致可以歸為2種類型，一類是NADP+-GAPDH，參與植物的卡爾文循環(huán)[6]，另一類是NAD+-GAPDH，參與糖酵解和糖異生過程[7]。

過去認為GAPDH基因在所有植物組織中幾乎都是高水平表達且表達量相對穩(wěn)定，所以常被用作研究其他功能性基因表達的內(nèi)參基因[8]。然而，新的研究結(jié)果表明，GAPDH是一種多功能酶[9]，除了參與植物基礎(chǔ)的新陳代謝外，也參與逆境脅迫下的抵御反應(yīng)[10-11]。GAPDH還廣泛參與植株的生長發(fā)育進程，如擬南芥GAPDH基因缺失突變體表現(xiàn)為根不能正常生長和花粉敗育[12-13]，生理型雄性不育小麥發(fā)育過程中種子在不同生長發(fā)育階段GAPDH基因表達量存在顯著差異[14]，擬南芥gapc1-1、gapc2-1基因雙敲除突變體的種子含油量與敲除前相比下降3%[15]。

當(dāng)前已有多種植物的GAPDH基因被克隆，如擬南芥[16]、番茄[17]、水稻[18]等，但是在芥菜中還未見相關(guān)報道。本研究基于芥菜的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[19]，克隆芥菜GAPDH基因，利用生物信息學(xué)方法對其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進化等方面進行全面預(yù)測和分析，并結(jié)合莖瘤芥不同膨大時期的糖酸含量變化，對BjuGAPC基因的表達進行相關(guān)性分析，為闡明該基因的表達在莖瘤芥莖膨大過程中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為涪雜2號莖瘤芥，采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)(成都校區(qū))第五教學(xué)實驗樓樓頂大棚。從瘤莖發(fā)育始期(2021年12月)開始取樣，橫徑間隔2 cm取樣1次，每次取 3 個生物學(xué)重復(fù)，共取樣 4次。取樣完立即放入冰盒帶回實驗室，所取樣品用清水將雜質(zhì)除凈，晾干水分，用液氮速凍后放于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 莖瘤芥總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取莖瘤芥總RNA，利用TSINGKE公司研發(fā)的GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.2BjuGAPC基因的克隆 利用Primer 6.0軟件設(shè)計用于克隆BjuGAPC基因編碼區(qū)全長和檢測該基因表達量的引物(表1)。以芥菜的cDNA 為模板進行克隆，擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s， 72 ℃ 10 s，35 個 循 環(huán)；72 ℃ 延 伸 5 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查條帶大小，對大小正確的條帶切膠后用DNA凝膠回收試劑盒(OMEGA公司)對PCR產(chǎn)物進行純化回收，連接轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選菌落PCR檢測，將篩選到的陽性菌落送至北京擎科生物科技有限公司進行測序驗證。

表1 BjuGAPC基因引物信息

1.2.3BjuGAPC基因在瘤莖膨大不同時期的表達分析 以莖瘤芥不同發(fā)育階段的cDNA為模板，以芥菜TUB基因為內(nèi)參基因[20]。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，53 ℃ 退火30 s，70 ℃延伸10 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延 伸 5 min。用2-△△Ct方法計算BjuGAPC基因的相對表達量。

1.2.4BjuGAPC基因的生物信息學(xué)分析 首先使用美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)在線工具ORF finder查找BjuGAPC基因的開放閱讀框。BjuGAPC蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)分析用在線分析工具ProtParam來完成。用在線分析軟件NetPhos3.1Server分析磷酸化位點和激酶特異性。采用糖基化位點在線預(yù)測軟件YinOYang1.2Server和NetNGlyc1.0Server對BjuGAPC基因編碼氨基酸的糖基化位點進行預(yù)測分析。利用ProtScale在線工具對BjuGAPC基因編碼的氨基酸序列進行親水性和疏水性分析。利用軟件PSORT Prediction分析BjuGAPC的亞細胞定位。用TMHMM在線工具預(yù)測BjuGAPC蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。用SignalP在線工具預(yù)測分析BjuGAPC蛋白中的信號肽。使用SOPMA和SWISS-MODEL在線工具預(yù)測蛋白質(zhì)的二、三級結(jié)構(gòu)。BjuGAPC基因編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域分析通過Pfam在線軟件進行。在NCBI的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP，并用DNAMAN軟件進行氨基酸多重序列比對，用MEGA7構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[21]。

1.2.5 糖酸含量的測定及統(tǒng)計分析 選擇長勢良好且一致的試驗材料，測定不同時期的糖酸含量，均進行3個生物學(xué)重復(fù)。可溶性糖、葡萄糖、蔗糖、果糖含量采用試劑盒測定，蔗糖試劑盒購自北京索萊寶有限公司，其他試劑盒購自南京建成生物工程研究所。試驗數(shù)據(jù)采用Excel和 SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BjuGAPC基因全長cDNA的克隆

以莖瘤芥涪雜2號cDNA為模板，設(shè)計特異性引物進行PCR擴增，擴增得到大小正確的條帶，將其命名為BjuGAPC基因(GenBank登錄號：OM100056)，見圖1。通過ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)，莖瘤芥GAPDH基因包含1個1 038 bp的完整開放閱讀框，編碼345個氨基酸以及包含1個終止密碼子。

圖1 BjuGAPC基因擴增電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic results of BjuGAPC gene amplification

2.2 BjuGAPC蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測

利用ProtParam對BjuGAPC蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果顯示,組成BjuGAPC 蛋白的氨基酸共有20種，其中纈氨酸(Val)所占比例最高，為11.3%，半胱氨酸(Cys)所占比例最低，為0.6%(圖2)。BjuGAPC 蛋白的分子式為C1 684H2 675N453O506S10，氨基酸數(shù)為 345，脂肪族氨基酸指數(shù)為 87.51，相對分子質(zhì)量為3.768×104；理論等電點為 7.10，屬于堿性蛋白質(zhì)類；從不穩(wěn)定系數(shù)為19.97和總平均親水性為-0.161來看，BjuGAPC蛋白屬于穩(wěn)定、親水性蛋白質(zhì)。

2.3 BjuGAPC蛋白的糖基化位點預(yù)測和磷酸化位點預(yù)測

糖基化位點預(yù)測結(jié)果表明,BjuGAPC蛋白有7個O-GlcNAc糖基化位點(圖3A)和2個N-糖基化位點(圖3B)，7個O-GlcNAc糖基化位點分別在第152位、287位絲氨酸 (Ser)和第191位、215位、288位、341位、344位蘇氨酸(Thr)處，2個N-糖基化位點分別在153～155 aa(天冬氨酸-絲氯酸-丙氨酸，N-A-S) 和342～344 aa(天冬氨酸-組氨酸-蘇氨酸，N-H-T) 處。

磷酸化位點和激酶特異性分析結(jié)果(圖3C)表明，BjuGAPC蛋白存在33個潛在的磷酸化位點，包括18個絲氨酸(Ser)、11個蘇氨酸(Thr)和4個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點。根據(jù)上述磷酸化位點所對應(yīng)的磷酸激酶預(yù)測結(jié)果，該蛋白質(zhì)可能有10個蛋白激酶C(PKC)、5個酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)、4個周期蛋白質(zhì)依賴性蛋白激酶(cdc2)、2個蛋白激酶G(PKG)、1個DNA依賴性蛋白激酶(DNAPK)、1個核糖體S6激酶(RSK)和1個酪蛋白激酶Ⅰ(CKⅠ)等7種保守的特異性蛋白激酶的結(jié)合位點。

蛋白質(zhì)氨基酸序列的親水性和疏水性分析結(jié)果(圖3D)表明，該蛋白質(zhì)的第340位脯氨酸(Pro)分值最低，親水性最強；第164位亮氨酸(Leu)分值最高，疏水性最強。從總體上來看，BjuGAPC蛋白的親水氨基酸數(shù)量稍多于疏水氨基酸，所以BjuGAPC基因編碼的蛋白質(zhì)最終表現(xiàn)為親水性。

Ala：丙氨酸；Arg：精氨酸；Asn：天冬酰胺；Asp：天冬氨酸；Cys：半胱氨酸；Gln：谷氨酰胺；Glu：谷氨酸；Gly：甘氨酸；His：組氨酸；Ile：異亮氨酸；Leu：亮氨酸；Lys：賴氨酸；Met：甲硫氨酸；Phe：苯丙氨酸；Pro：脯氨酸；Ser：絲氨酸；Thr：蘇氨酸；Trp：色氨酸；Tyr：酪氨酸；Val：纈氨酸。圖2 BjuGAPC蛋白的氨基酸序列組成Fig.2 Amino acid sequence composition of BjuGAPC protein

A：O-GlcNAc糖基化位點預(yù)測；B：N-糖基化位點預(yù)測；C：激酶特異性預(yù)測；D：親疏水性預(yù)測。圖3 BjuGAPC蛋白的糖基化位點、磷酸化位點預(yù)測和親疏水性預(yù)測Fig.3 Prediction of glycosylation site, phosphorylation site, hydrophilicity and hydrophobicity of BjuGAPC protein

2.4 BjuGAPC蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位預(yù)測

信號肽分析結(jié)果(圖4A)表明，BjuGAPC基因編碼的蛋白質(zhì)序列中不存在已知的信號肽。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果(圖4B)表明，在整個BjuGAPC氨基酸序列中，沒有發(fā)現(xiàn)可以與膜結(jié)合的區(qū)域或者跨膜結(jié)構(gòu)，因此推測該蛋白質(zhì)屬于非跨膜蛋白質(zhì)。結(jié)合信號肽預(yù)測分析結(jié)果可知，跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽的缺失說明BjuGAPC蛋白不是分泌蛋白質(zhì)，而是一種由游離核糖體合成再進入細胞質(zhì)的蛋白質(zhì)。因此推測BjuGAPC蛋白可能定位于細胞質(zhì)。

亞細胞定位分析結(jié)果表明，BjuGAPC基因最有可能在微體和細胞質(zhì)中發(fā)揮功能，有極小可能定位于葉綠體基質(zhì)和葉綠體類囊體薄膜中，這與信號肽預(yù)測結(jié)果一致。由此分析，BjuGAPC蛋白可能在細胞質(zhì)中合成，在糖酸合成過程中有一定的調(diào)控作用。

A：BjuGAPC蛋白的信號肽預(yù)測；B：BjuGAPC蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。圖A中C代表剪切位置分值，S代表信號肽分值，Y代表綜合剪切位置分值。圖4 BjuGAPC蛋白的信號肽預(yù)測和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.4 Prediction of signal peptide and transmembrane domain of BjuGAPC protein

2.5 BjuGAPC蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，BjuGAPC蛋白的二級結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲4種。其中構(gòu)成α-螺旋(Hh)結(jié)構(gòu)的有111個氨基酸，占比32.17%；構(gòu)成β-折疊(Tt)結(jié)構(gòu)的有22個氨基酸，占比6.38%；構(gòu)成延伸鏈(Ee)結(jié)構(gòu)的有83個氨基酸，占比24.06%；構(gòu)成無規(guī)則卷曲(Cc)結(jié)構(gòu)的有129個氨基酸，占比37.39%。

BjuGAPC蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果(圖5)顯示，用于建立其三級結(jié)構(gòu)模型的氨基酸殘基位于第5～338位，覆蓋度高達96%，表明BjuGAPC蛋白能夠形成同源四聚體，并且結(jié)合4個NAD+配體。

圖5 BjuGAPC蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of tertiary structure of BjuGAPC protein

2.6 BjuGAPC的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析和氨基酸序列的同源性分析

由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果(圖6A)可知，BjuGAPC蛋白上有2個高度保守的超家族結(jié)構(gòu)域Gp_dh_N(NAD+結(jié)合結(jié)構(gòu)域)和Gp_dh_C(C端甘油醛-3-磷酸脫氫酶亞家族結(jié)構(gòu)域)，分別位于第6～109位和第161～318位氨基酸殘基，表明BjuGAPC基因?qū)儆贕APDH基因家族。

利用BjuGAPC的氨基酸序列在NCBI上進行BLASTP，結(jié)果顯示BjuGAPC蛋白的氨基酸序列與蕪菁(XP_009125005.2)、油菜(XP_013742255.1)、蘿卜(XP_018432846.1)、番茄(NP_001266254.2)、萵苣(XP_023733724.1)、馬鈴薯(NP_001275344.1)、擬南芥(NP_172801.1)的GAPDH基因編碼的氨基酸序列具有高度相似性，其中與同科的蕪菁、 油菜、蘿卜的序列相似度高達98%以上，與其他物種的序列相似度均為92%以上。采用 DNAMAN軟件將上述7個物種的GAPDH與BjuGAPC的蛋白質(zhì)氨基酸序列進行多重比對，結(jié)果(圖6B)顯示：芥菜BjuGAPC的氨基酸序列與其他物種的GAPDH基因編碼的氨基酸序列相似度極高。表明BjuGAPC同源蛋白質(zhì)具有相似性和保守性，尤其表現(xiàn)在Gp_dh_N和Gp_dh_C兩個保守結(jié)構(gòu)域，因此猜測它們之間可能有著相同的生物學(xué)功能。

2.7 BjuGAPC蛋白的系統(tǒng)進化分析

為了探究BjuGAPC蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進化關(guān)系，從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取了19個物種的GAPDH蛋白氨基酸序列。在MEGA 7中用鄰接法(Neighbor-joining)對20個蛋白質(zhì)氨基酸序列進行分析，設(shè)置校驗bootstrap=1 000，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖7)。

A：BjuGAPC蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測；B：BjuGAPC與其他植物GAPDH氨基酸序列比對。圖中黑色方框中的區(qū)域為Gp_dh_N結(jié)構(gòu)域，灰色方框中的區(qū)域為Gp_dh_C結(jié)構(gòu)域。Consensus:共有序列。圖6 BjuGAPC蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測和同源性分析Fig.6 Domain prediction and homology analysis of BjuGAPC protein

結(jié)果表明，BjuGAPC蛋白與同為蕓薹屬的蕪菁(Brassicarapa)的親緣關(guān)系最近，其次是甘藍(Brassicaoleracea)和油菜(Brassicanapus)，與同為十字花科的高山南芥(Arabisalpina)、白芥(Sinapisalba)、蘿卜(Raphanussativus)的親緣性也較高，與罌粟(Papaversomniferum)、水青樹(Tetracentronsinense)、松蒿(Phtheirospermumjaponicum)、博落回(Macleayacordata)等其他物種的關(guān)系較遠。

2.8 不同時期瘤狀莖糖酸含量變化與 BjuGAPC基因表達的關(guān)系

分別以膨大到橫徑為2 cm、4 cm、6 cm、8 cm(S1、S2、S3和S4時期)的莖瘤芥瘤莖為材料，測定不同時期瘤狀莖糖酸含量、糖酸比。結(jié)果(表2)表明：糖酸的含量變化隨著瘤狀莖的發(fā)育有所不同，在發(fā)育前期莖中可溶性糖大量積累，還原糖(葡萄糖和果糖)含量較低；在發(fā)育后期，蔗糖和還原糖在莖中均有積累現(xiàn)象，而糖酸比整體出現(xiàn)先降低后升高的趨勢。

圖7 基于20個物種GAPDH蛋白的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.7 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of GAPDH proteins in 20 species

由BjuGAPC基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(圖8A)和qRT-PCR分析得出的基因相對表達量(圖8B)看出：轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR分析結(jié)果呈現(xiàn)一致趨勢，BjuGAPC基因在瘤莖膨大過程中不同時期的相對表達量不同，且差異達到顯著水平；隨著瘤莖的逐步膨大，BjuGAPC基因的相對表達量逐漸減少，在瘤莖橫徑膨大到6 cm時基因的相對表達量降至最低值，之后小幅度上升。

相關(guān)性分析結(jié)果(表3)顯示，可溶性糖含量與糖酸比呈顯著正相關(guān)關(guān)系，可滴定酸含量與糖酸比呈顯著負相關(guān)關(guān)系，基因的相對表達量與可溶性糖含量、可滴定酸含量和糖酸比均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。結(jié)果表明，BjuGAPC基因?qū)Σ煌瑫r期瘤狀莖糖酸含量起到一定的正向調(diào)控作用，且在橫徑為2 cm、4 cm時相對表達量較高，橫徑為6 cm、8 cm時相對表達量較低。

由此可見，BjuGAPC基因在瘤莖膨大的不同時期有明顯的表達特異性，推測其在莖瘤芥莖生長發(fā)育過程中具有特定的表達模式，并在一定程度上影響了糖酸比。BjuGAPC蛋白在該過程中也發(fā)揮一定的功能，主要在瘤莖膨大前期起作用。

3 討論與結(jié)論

為進一步了解GAPDH在莖瘤芥莖膨大過程中的作用，本試驗基于芥菜的基因組數(shù)據(jù)庫，克隆得到BjuGAPC基因。預(yù)測BjuGAPC蛋白相對分子質(zhì)量為3.768×104，是一個具有堿性、親水性的穩(wěn)定蛋白質(zhì)。GAPDH是高等植物糖酵解反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，能夠維持植物的生命活動，按照生化特性可分為磷酸化GAPDH和非磷酸化GAPDH兩大類[22]。通過分析BjuGAPC蛋白的磷酸化位點，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)存在33個潛在的磷酸化位點，推測其可能參與糖酵解途徑，對糖酸合成起到一定的調(diào)控作用。

表2 不同采樣時期莖瘤芥瘤狀莖的糖酸含量

S1、S2、S3和S4時期分別指瘤狀莖膨大到橫徑為2 cm、4 cm、6 cm、8 cm的時期。不同時期對應(yīng)的柱上標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8 BjuGAPC基因不同時期的表達豐度(A)與 qRT-PCR表達分析(B)Fig.8 Expression abundance(A) and qRT-PCR expression analysis (B)of BjuGAPC gene at different stages

表3 不同時期莖瘤芥瘤狀莖糖酸含量與基因表達量間的相關(guān)性

蔗糖是植物生長發(fā)育過程中各種調(diào)控機制的信號，它還影響編碼轉(zhuǎn)運蛋白、貯藏蛋白和應(yīng)激反應(yīng)的基因的表達[23-27]。在瘤狀莖發(fā)育期間，在發(fā)育前期莖中蔗糖大量積累，還原糖含量較低。在發(fā)育后期，蔗糖和還原糖在莖中均有積累現(xiàn)象。這說明BjuGAPC基因在前期相對表達量較多，同時由于葉片中還原糖能較快地轉(zhuǎn)化為蔗糖，所以能迅速輸送到莖中用于其他物質(zhì)的合成，而在發(fā)育后期，由于植株機體機能逐漸衰退，BjuGAPC基因相對表達量降低，瘤狀莖中其他物質(zhì)合成能力減弱，合成的蔗糖減少，還原糖含量相對下降。

根據(jù)磷酸化的GAPDH在細胞中的不同定位可將其分為GAPC、GAPCp和GAPA/B三類[28-29]。試驗中發(fā)現(xiàn)BjuGAPC的蛋白質(zhì)序列中不存在已知的信號肽，并且沒有任何跨膜結(jié)構(gòu)或膜結(jié)合區(qū)域，說明該蛋白質(zhì)不是分泌蛋白，不經(jīng)過跨膜轉(zhuǎn)運，而是在細胞質(zhì)中直接形成，亞細胞定位預(yù)測結(jié)果也證實了這一點。因此，BjuGAPC蛋白屬于GAPC，定位于細胞質(zhì)中。從系統(tǒng)進化樹可以看出，分支點越接近，物種間的親緣性越相似，說明編碼這些蛋白質(zhì)的基因間的功能也具有一定的相似性，同時說明GAPDH基因家族蛋白質(zhì)遺傳進化比較保守。BjuGAPC蛋白之所以能行使生物學(xué)功能是因為其特定的空間結(jié)構(gòu)。通過三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，BjuGAPC蛋白能夠形成同源四聚體，并且結(jié)合4個NAD+配體。由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果可知，BjuGAPC的2個超家族結(jié)構(gòu)域Gp_dh_N和Gp_dh_C中，前者是輔酶NAD+的結(jié)合域，后者是行使糖運輸和代謝的功能域，推測BjuGAPC基因的表達產(chǎn)物在莖瘤芥細胞質(zhì)中參與糖酵解過程，符合上述所推測的BjuGAPC的結(jié)構(gòu)和功能特征。

以前的多種研究結(jié)果普遍表明，GAPDH基因在同一組織的不同生理狀態(tài)下或同一生物體的不同組織中均相對穩(wěn)定且高水平表達，因此可以作為內(nèi)參基因來進行其他功能基因的表達差異分析。但是，本研究通過qRT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，BjuGAPC基因在莖瘤芥莖膨大不同時期有明顯的表達特異性，不同時期糖酸比測定結(jié)果顯示，BjuGAPC基因相對表達量隨不同時期變化與糖酸比含量呈現(xiàn)出一致趨勢，說明BjuGAPC基因參與了莖瘤芥的生長發(fā)育過程，并且主要在瘤莖膨大前期發(fā)揮功能。GAPDH基因可以作為多物種分子生物學(xué)研究的內(nèi)參基因，但是在本試驗的芥菜發(fā)育過程中表達差異較大，這可能是由于物種不同導(dǎo)致的特異性差異所決定的。

在對BjuGAPC蛋白的磷酸化位點分析中，發(fā)現(xiàn)了植物抗逆相關(guān)特異性蛋白質(zhì)激酶的結(jié)合位點，也可以說明GAPDH在功能上與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)。一些研究者的轉(zhuǎn)基因試驗結(jié)果也表明，GAPDH缺失或過表達均會在一定程度上影響植物的代謝和生長發(fā)育[30]，并且GAPDH基因的表達水平會隨著內(nèi)外源誘導(dǎo)因子的變化而變化，推測BjuGAPC蛋白中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激素調(diào)控等的O-GlcNAc糖基化位點和N-糖基化位點與此有關(guān)[31-32]。糖酸含量分析結(jié)果表明，BjuGAPC蛋白參與了糖代謝過程。目前，有關(guān)芥菜GAPDH功能和作用機制的相關(guān)報道還很少，本試驗對BjuGAPC基因的克隆可以為分析逆境脅迫條件下BjuGAPC基因的表達模式、探討B(tài)juGAPC在莖瘤芥莖膨大過程中的作用奠定基礎(chǔ)，后續(xù)還可以進一步構(gòu)建植物表達載體，通過轉(zhuǎn)基因等途徑深入探究BjuGAPC基因在逆境脅迫和莖瘤芥莖膨大過程中的功能。此外，本研究結(jié)合不同時期糖酸比變化趨勢，驗證了莖瘤芥BjuGAPC基因確實對糖酸含量起到正向調(diào)控作用。