褪黑素引發處理提高朝天椒種子萌發及幼苗耐鹽性的生理機制

魏茜雅， 林欣琪， 梁臘梅， 秦中維， 李映志

(廣東海洋大學濱海農學院，廣東湛江524088)

辣椒(CapsicumannuumL.)起源于南美洲，是一年生或有限多年生蔬菜作物，屬淺根系植物，根系吸水能力較弱[1]。中國各地均有種植。近年來中國辣椒種植面積穩定在2.10×106hm2以上，農業產值高達2.5×1011元，已成為中國種植面積最大、消費量最大、加工方式最多的蔬菜[2]。但近年來，在對山東、遼寧、江蘇、四川的實地調查中發現，溫室大棚栽培條件下，土壤表面均有大面積白色鹽霜出現，有的甚至出現塊狀紫紅色膠狀物，土壤鹽化板結，作物長勢差，甚至絕產，其中以山東、江蘇兩省設施栽培的土壤鹽漬化程度最為嚴重[3]。因此，生產上對耐鹽辣椒品種或耐鹽栽培措施的需求十分迫切。

近年來，種子引發技術在很多農作物和園藝作物中得到廣泛研究和應用，該技術不僅可以提高種子的萌發速度，還能提高幼苗對干旱、重金屬離子和鹽脅迫等的抗逆性[4]。在辣椒種子引發處理上，吳凌云等[5]通過蛭石和硝酸鉀(KNO3)對辣椒種子進行引發，發現蛭石和KNO3引發都可以提高辣椒種子的萌發和幼苗生長；白占兵等[6]發現，適量的赤霉素(GA3)可以促進辣椒種子萌發和幼苗生長；Ahmed等發現水楊酸能有效緩解鹽脅迫對甜椒生理和形態特征的抑制作用[7]。

褪黑素(Melatonin，MT)為色氨酸吲哚類衍生物，具有很強的抗氧化作用，能促進植物側根的生長并延緩葉片衰老[8-9]。褪黑素也被用于農作物的種子引發處理，如減輕干旱脅迫對生菜幼苗生長的影響[10]；促進老化燕麥種子的萌發[11]；提高紫花苜蓿的耐鹽能力[12]；降低鹽分脅迫對棉花種子的影響[13]等。然而，使用褪黑素對辣椒種子進行引發處理的研究還鮮見報道。

本試驗利用不同濃度的褪黑素對朝天椒種子進行引發處理，分析其對鹽脅迫下朝天椒種子萌發和幼苗生長的影響及引發后種子和幼苗生理指標變化，探究褪黑素引發處理的作用機制。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試驗設計

供試朝天椒品種為茂蔬360。

將均勻飽滿的朝天椒種子分別浸在濃度為0 μmol/L(T0)、1 μmol/L(T1)、5 μmol/L(T5)、25 μmol/L(T25)、50 μmol/L(T50)、75 μmol/L(T75)、100 μmol/L(T100)、125 μmol/L(T125)、150 μmol/L(T150)和200 μmol/L(T200)的10 ml褪黑素溶液中，在室溫、黑暗條件下引發12 h，隨后濾出種子，用蒸餾水沖洗干凈，于25 ℃的暗室中自然風干至原始含水量。以未引發處理的種子為對照(CK)，取上述不同濃度褪黑素引發處理和CK的朝天椒種子各1～2 g，分3次重復，進行種子生理指標的測定。

將三層濾紙無褶皺的鋪墊在玻璃培養皿中，并用100 mmol/L 鹽液(NaCl溶液)完全浸濕濾紙。取經不同濃度褪黑素引發處理后的朝天椒種子和未引發處理的朝天椒種子，間距均勻擺放在培養皿中，每皿放置60粒種子，每處理3次重復。于溫度為25 ℃的恒溫培養箱中培養，每天補充處理液，保證濾紙濕潤。以胚根長到與種子等長及以上，且胚芽長到種子長度一半以上為發芽標準[14]。每天記錄發芽種子數，第12 d結束萌發試驗。萌發結束后每個處理取中等長勢的幼苗3株，測量胚根、胚芽長度。

用蒸餾水將鹽液(100 mmol/L)脅迫下發芽的種子沖洗干凈，挑選每個處理中萌發的種子播至含NaCl(100 mmol/L)的基質中，置于人工氣候箱內生長。人工氣候箱設置溫度為25 ℃，光照周期為12 h光照/12 h黑暗, 光照度為7 600 lx，相對濕度為60%。每2 d澆灌一次鹽液(100 mmol/L NaCl)，處理7 d后，將朝天椒幼苗的根系用去離子水清洗干凈后吸干表面水分，取各處理中等長勢的幼苗5株，重復3次，稱得地上部鮮質量、根鮮質量及植株鮮質量(地上部鮮質量+根鮮質量)，測量株高、根長和植株全長(株高+根長)[15]。進一步將上述鮮樣置于105 ℃烘箱中殺青15 min, 再在80 ℃下干燥至恒質量后，測定植株干質量(地上部干質量+根干質量)[16]。各處理稱取鮮質量1～2 g幼苗葉片，重復3次，進行生理指標測定。

1.2 指標測定及萌發能力綜合評價方法

1.2.1 種子萌發相關指標的算法 根據《國際種子檢驗規程》及相關文獻計算下列指標[17-21]：

發芽勢(GP)=種子發芽達日高峰時的累計發芽數/供試種子數×100%

發芽率(GR)=發芽結束后發芽種子數量/供試種子數×100%；

式中，i為發芽天數，Gi為第i天的發芽數。

活力指數=GI×S

式中，GI表示發芽指數；S為第12 d朝天椒幼苗根的長度。

1.2.2 種子萌發能力綜合評價 用下式計算某一指標的隸屬函數值：

Y=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中，Y表示該指標的隸屬函數值，X表示該指標的測定值，Xmax和Xmin分別表示不同處理下該指標的最大值和最小值[15]。

進一步計算各指標的隸屬函數值均值得到不同處理下種子萌發能力綜合評價指標。

1.2.3 生理指標的測定方法 可溶性糖(SS)含量的測定采用蒽酮比色法[22]；丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸比色法[22]；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性采用Nakano法測定[23]；可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍G-520法測定[22]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定[24]、脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮法測定[25]、過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定[26]、過氧化氫(H2O2)含量采用硫酸鈦比色法測定[27]；超氧化物歧化酶(SOD)活性使用黃嘌呤氧化酶-NBT法測定[28]；超氧陰離子(O2·-)含量采用羥胺氧化法測定[29]；抗壞血酸(AsA)含量和脫氫抗壞血酸(DHA)含量測定采用分光光度法[30]。

1.3 數據處理

采用 Microsoft Excel 2019 軟件和 SPSS 24.0軟件進行統計分析和繪圖。使用Duncan’s新復極差法進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度褪黑素引發處理對鹽脅迫下朝天椒種子萌發的影響

在100 mmol/L 鹽脅迫下，不同濃度褪黑素引發處理后的朝天椒種子的萌發情況如圖 1 所示。由圖1可知，褪黑素溶液濃度低于100μmol/L時，隨褪黑素引發濃度的增加，朝天椒種子發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數總體都呈增加趨勢；但隨著褪黑素濃度的進一步增加，各發芽指標都呈現減少趨勢。與未引發處理的種子相比，100 μmol/L褪黑素溶液引發處理的朝天椒種子發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數分別增加了33.84%、120.27%、108.13%和312.71%，差異顯著。這表明鹽脅迫下，適宜濃度的褪黑素引發處理能顯著增強朝天椒種子的萌發能力，本試驗條件下最適的褪黑素引發濃度為100 μmol/L。

2.2 不同濃度褪黑素引發處理對鹽脅迫下朝天椒幼苗植株全長、根長、鮮質量和干質量的影響

100 mmol/L鹽脅迫下，不同濃度褪黑素引發處理后的朝天椒幼苗的植株全長、根長、株高和根長/株高比值情況如圖 2 所示。由圖2可知，褪黑素溶液濃度低于100μmol/L時，隨褪黑素引發濃度的增加，朝天椒幼苗的植株全長、根長和株高總體都呈增加趨勢；但隨著褪黑素濃度的進一步增加，各指標都呈現減少趨勢。與未引發處理相比，100 μmol/L褪黑素溶液引發處理的朝天椒幼苗植株全長、根長和株高分別增加了96.20%、96.48%和95.87%，差異顯著；但根長/株高值在褪黑素濃度25 μmol/L 時為最大值，比未引發處理對照增加了38.21%，但差異不顯著。

柱形圖上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200表示褪黑素引發處理濃度分別為0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L、125 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L的處理，CK為未引發處理對照。圖1 不同濃度褪黑素引發處理對鹽脅迫下朝天椒種子發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數的影響Fig.1 Effects of different melatonin-soaked concentrations on germination potential, germination percentage, germination index and vitality index of pepper under salt stress

柱形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖2 不同濃度褪黑素引發處理對鹽脅迫下朝天椒幼苗植株全長、根長、株高和根長/株高比值的影響Fig.2 Effects of different melatonin-soaked concentrations on plant height(PH), root length(RL), PH+RL and RL/(PH+RL) of pepper seedlings under salt stress

100 mmol/L鹽脅迫下，不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒植株鮮質量、根鮮質量、地上鮮質量和植株干質量的影響如圖3所示。由圖3可知，隨著褪黑素引發液濃度的增加，植株鮮質量、根鮮質量、地上鮮質量和植株干質量呈拋物線變化趨勢。褪黑素濃度為100 μmol/L 時，植株鮮質量、根鮮質量、地上鮮質量和植株干質量達到最大值，分別比未引發處理對照增加了48.61%、102.57%、52.99%和180.00%，差異顯著。

柱形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖3 不同濃度褪黑素引發處理對鹽脅迫下朝天椒植株鮮質量、根鮮質量、地上部分鮮質量和植株干質量的影響Fig.3 Effects of different melatonin-soaked concentrations on plant fresh weight, root fresh weight, shoot fresh weight and plant dry weight of pepper under salt stress

2.3 不同濃度褪黑素引發處理對鹽脅迫下朝天椒種子萌發及幼苗生長效果的綜合評價

采用隸屬函數計算綜合指標可以清晰判斷不同濃度的褪黑素引發處理對朝天椒種子萌發及幼苗抗鹽性的作用大小[31]。由表1可知，在鹽脅迫下，隸屬函數綜合分析結果顯示T100>T125>T75>T50>T150>T25>T5>T0>T1>T200>CK。T100處理的綜合得分值最高，即褪黑素濃度為100 μmol/L時引發的效果最好。

表1 鹽脅迫下不同濃度褪黑素引發處理后朝天椒各測定指標的隸屬函數值

2.4 不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒種子生理的影響

2.4.1 不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒種子丙二醛和ROS含量的影響 如圖4所示，不同濃度褪黑素引發處理后的朝天椒種子的丙二醛和過氧化氫含量隨著褪黑素濃度的增加呈現先降低后上升的趨勢，褪黑素濃度為100 μmol/L時，引發后種子的丙二醛和過氧化氫含量達最小值，分別比未引發處理對照降低了74.26%、67.16%，差異顯著；引發處理后的朝天椒種子的超氧陰離子含量與未引發處理對照相比無顯著性差異。

柱形圖上不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖4 不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒種子MDA、過氧化氫和超氧陰離子含量的影響Fig.4 Effects of different melatonin-soaked concentrations on the contents of malondialdehyde (MDA), hydrogen peroxide and superoxide anion in pepper seeds

2.4.2 不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒種子可溶性糖(SS)、可溶性蛋白(SP)和脯氨酸(Pro)含量的影響 如圖5所示，當褪黑素濃度低于100μmol/L時，隨著褪黑素濃度的增加，朝天椒種子的SS、SP和Pro含量總體上呈增加趨勢。濃度為100 μmol/L時，朝天椒種子的SS、SP和Pro含量達到最大值，分別比未引發處理對照增加51.88%、157.54%和28.72%，差異顯著。但隨著褪黑素濃度的進一步增加，朝天椒種子的SS、SP和Pro含量呈現下降趨勢。

2.4.3 不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒種子POD和CAT活性的影響 如圖6所示，不同濃度褪黑素引發處理后，隨著引發液濃度的增加，朝天椒種子的POD和CAT活性呈拋物線變化趨勢。褪黑素濃度為100 μmol/L時，引發處理后種子的POD和CAT活性為最大值，分別比未引發處理對照增加了185.57%和53.23%，差異顯著。

2.4.4 不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒種子APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值的影響 如圖7所示，不同濃度褪黑素引發處理后的朝天椒種子的APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值隨著褪黑素濃度的增加總體上呈拋物線變化趨勢，濃度為100 μmol/L時，引發處理后種子的APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值達最大值，分別比未引發處理種子增加了27.57%、1 377.00%、41.19%和880.37%，差異顯著。

2.5 褪黑素種子引發處理對朝天椒鹽脅迫下幼苗生理的影響

2.5.1 褪黑素種子引發處理對朝天椒鹽脅迫下幼苗丙二醛和ROS含量的影響 如圖8所示，在100 mmol/L鹽脅迫下，經不同濃度褪黑素引發處理后幼苗丙二醛含量在75 μmol/L時含量達最小值，比未引發處理對照降低了37.54%，差異顯著；過氧化氫和超氧陰離子含量在100 μmol/L時含量達最小值，分別比未引發處理對照降低了58.65%和42.00%，差異顯著。

柱形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖5 不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒種子可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.5 Effects of different melatonin-soaked concentrations on soluble sugar, soluble protein and proline contents of pepper seeds

柱形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖6 不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒種子POD和CAT活性的影響Fig.6 Effects of different melatonin-soaked concentrations on peroxidase (POD) and catalase (CAT) activities of pepper seeds

柱形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖7 不同濃度褪黑素引發處理對朝天椒種子APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值的影響Fig.7 Effects of different melatonin-soaked concentrations on ascorbate peroxidase (APX) activity, ascorbic acid (AsA) content, dehydroascorbic acid (DHA) content and AsA/DHA value of pepper seeds

2.5.2 褪黑素種子引發處理對朝天椒鹽脅迫下幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響 如圖9所示，在100 mmol/L鹽脅迫下，經不同濃度褪黑素引發處理后幼苗的可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量隨著褪黑素溶液濃度的增大呈先增大后下降的趨勢，并在100 μmol/L時達到最大值，分別比未引發處理對照增加了38.89%、384.61%和37.46%，差異顯著。

2.5.3 褪黑素種子引發處理對朝天椒鹽脅迫下幼苗SOD、POD和CAT活性的影響 如圖10所示，在100 mmol/L鹽脅迫下，隨著褪黑素溶液濃度的增大，經不同濃度褪黑素引發處理后的幼苗SOD、POD和CAT活性呈先增大后下降的趨勢，SOD和POD活性在100 μmol/L達最大值，分別比未引發處理對照增加了240.24%和398.59%，差異顯著；CAT活性在75 μmol/L達最大值，比未引發處理對照增加了275.60%，差異顯著。

2.5.4 褪黑素種子引發處理對朝天椒鹽脅迫下幼苗APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值的影響 如圖11所示，在100 mmol/L鹽脅迫下，褪黑素溶液濃度低于100μmol/L時，隨褪黑素引發處理濃度的增加，朝天椒幼苗的APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值都呈增加趨勢；但隨著褪黑素濃度的進一步增加，各指標都呈現減少趨勢。與未引發處理對照相比，100 μmol/L褪黑素溶液引發處理的朝天椒幼苗的APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值分別增加了106.89%、618.35%、134.26%和206.78%，差異顯著。

柱形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖8 褪黑素種子引發處理對朝天椒鹽脅迫下幼苗MDA、過氧化氫和超氧陰離子含量的影響Fig.8 Effects of different melatonin-soaked concentrations on MDA, hydrogen peroxide and superoxide anion contents of pepper seedlings under salt stress

柱形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖9 褪黑素種子引發處理對朝天椒鹽脅迫下幼苗可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.9 Effects of different melatonin-soaked concentrations on soluble sugar, soluble protein and proline contents of pepper seedlings under salt stress

柱形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖10 褪黑素種子引發處理對朝天椒鹽脅迫下幼苗SOD、POD和CAT活性的影響Fig.10 Effects of different melatonin-soaked concentrations on superoxide dismutase (SOD), POD and CAT activities of pepper seedlings under salt stress

柱形圖上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。T0、T1、T5、T25、T50、T75、T100、T125、T150、T200及CK見圖1注。圖11 褪黑素種子引發處理對朝天椒鹽脅迫下幼苗APX活性及AsA、DHA含量和AsA/DHA值的影響Fig.11 Effects of different melatonin-soaked concentrations on APX activity, AsA content, DHA content and AsA/DHA value of pepper seedlings under salt stress

3 討論

3.1 不同濃度褪黑素引發處理對鹽脅迫下朝天椒種子萌發的影響

種子萌發不僅代表著植物生命的開始，更是植物生活史耐鹽性最差的階段，其發芽率與植物耐鹽堿能力密切相關。本研究結果表明，100 μmol/L的褪黑素種子引發處理可最大程度促進鹽脅迫下朝天椒種子的萌發和幼苗生長；較高濃度(150 μmol/L、200 μmol/L)的褪黑素引發處理則會對種子在鹽脅迫下的萌發產生不利影響，這與劉佳奇等[32]發現NaCl脅迫下，褪黑素種子引發處理能夠明顯促進小麥種子萌發的結果一致。100 μmol/L的褪黑素種子引發處理促進鹽脅迫下的朝天椒種子萌發的原因可能是褪黑素引發處理促進了種子內抗氧化酶(POD、CAT、APX)活性、SS、SP、Pro和抗壞血酸含量的升高，并降低了種子內丙二醛和過氧化氫的含量，從而促進了種子的活力，并為種子萌發提供了能量[33]。高濃度(150 μmol/L、200 μmol/L)褪黑素引發處理后，反而增加了種子丙二醛和ROS含量并降低了抗氧化酶活性，表明其導致了種子細胞膜系統的損傷，降低了種子的氧自由基清除能力。

3.2 不同濃度褪黑素引發處理對鹽脅迫下朝天椒幼苗生長的影響

當植物受到鹽脅迫時，植物細胞失水，細胞壁破裂，甚至死亡[13]。本研究結果表明，100 μmol/L褪黑素引發處理后，鹽脅迫下幼苗的植株全長、根長、鮮質量和干質量顯著增加，說明100 μmol/L褪黑素引發處理能夠促進幼苗生物量的積累以及植株發育；25 μmol/L褪黑素引發處理后，鹽脅迫下幼苗的根長/株高值顯著增加，說明25μmol/L褪黑素引發處理能夠促進幼苗根系的發育。與陳莉等[13]發現低濃度褪黑素引發處理棉花種子可以顯著提高幼苗生物量及胚根長；與蔣航等[34]研究發現褪黑素可以抵抗砷的毒害提高水稻根長和芽長的結果一致。

當植物受到脅迫時，植物體內氧代謝失調，導致各種膜結構受到過量ROS的破壞，形成氧化脅迫[35-37]。本研究結果表明，100 μmol/L褪黑素引發處理后，鹽脅迫下幼苗的丙二醛和ROS含量顯著降低，滲透調節物質含量和抗氧化酶(SOD和POD)的活性顯著增加；75～125 μmol/L褪黑素引發處理后CAT顯著增加，說明75～125 μmol/L褪黑素引發處理能緩解鹽脅迫造成的細胞過氧化傷害，從而提高幼苗的耐鹽性。這與郭驚濤等[38]用褪黑素引發處理蘿卜種子來提高幼苗滲透調節物質和抗氧化酶活性去促進幼苗生長和銀珊珊等[39]使用褪黑素引發處理黃瓜種子提高幼苗滲透調節物質并降低丙二醛和ROS含量來抵抗干旱脅迫的研究結果一致。AsA可以在APX作用下與 H2O2反應生成 H2O，清除H2O2的毒性[40]。本研究結果表明，100 μmol/L褪黑素引發處理后，鹽脅迫下幼苗的APX活性及AsA、DHA 含量和AsA/DHA值都顯著增加，說明100 μmol/L褪黑素引發處理能提高朝天椒幼苗中AsA的產生速率，提高AsA/DHA值，增強朝天椒幼苗抗鹽脅迫的能力。這與李富宏[41]發現噴施褪黑素能通過提高抗壞血酸過氧化物酶活性和抗壞血酸等含量提高幼苗耐鹽性研究結果一致。