中華雙環粒蟹奴寄生對紅星梭子蟹蛻皮相關激素和基因表達量

楊長平，劉 巖，單斌斌，王良明，孫典榮*

(1.中國水產科學研究院南海水產研究所熱帶水產研究開發中心,海南三亞 572018;2.中國水產科學研究院南海水產研究所/農業農村部南海漁業資源開發利用重點實驗室,廣東廣州 510300;3.華南師范大學生命科學學院/廣東省水產健康安全養殖重點實驗室,廣東廣州 510631)

中華雙環粒蟹奴(DiplothylacussinensisKeppen,1877)隸屬于節肢動物門蔓足下綱根頭目粒蟹奴科，是一種流行于熱帶、亞熱帶海區的甲殼類寄生蟲，通常寄生于紅星梭子蟹、遠海梭子蟹、鋸緣青蟹等大型經濟蟹類的腹部[1-2]。受寄生的宿主蟹通常無法正常完成蛻皮周期，生長受到抑制，表現出個體小型化、肉質變差、含肉率下降等不良癥狀，嚴重者甚至導致死亡[3-4]。在蟹類的實際生產養殖中，蟹奴疾病通常難以防治，迄今缺乏行之有效的藥物能對其進行根治，蟹奴疾病一旦暴發，將會造成巨大的經濟損失[5]。

蛻皮是甲殼動物的重要生理現象，是其生長和發育的標志性特征。但蛻皮是一個十分復雜的過程，伴隨著眾多的生理和生化反應，需要各種器官分泌激素相互協調才能順利進行，蟹類蛻皮的生理調節機制受到了廣泛關注[6]。十足目甲殼動物的蛻皮過程受內分泌系統和生神經系統雙重調節，通過調控Y-器官(Y-organ,YO)合成蛻皮激素(ecdysteroid hormone,EH)以及位于眼柄的X器官-竇腺復合體(X-organ sinus gland,XO-SG)分泌蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone,MIH)相互拮抗而完成蛻殼[6]。EH與蛻皮激素受體(ecdysone receptor,EcR)相結合構成轉錄因子，起著調節甲殼類體內蛋白、糖類物質和礦物質代謝的作用，從而促進其蛻皮和外骨骼生長[7]。在不同生長時期，甲殼動物的蛻皮抑制激素分泌水平會有所不同，在蛻皮前期，蛻皮抑制激素含量逐漸降低，在蛻皮后急劇上升，與血淋巴中蛻皮激素的含量成反比[8]。

高血糖激素家族(crustacean hyperglycemic hormone family)神經肽是竇腺中含量最豐富的多肽類激素之一，同時也是甲殼動物類群特有的神經肽，該家族包括高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)、蛻皮抑制激素、離子轉運蛋白(ion-transport protein,ITP)、性腺抑制激素(gonad-inhibiting hormone,GIH)和大額器抑制激素(mandibular organ-inhibiting hormone,MOIH)[9]。MIH作為CHH家族神經肽的成員之一，主要分布于眼柄端髓X-器官、胸神經節、腹神經節等中樞神經系統，其作用是通過抑制Y-器官EH的合成與分泌，從而達到抑制甲殼動物蛻殼[6,9-10]。另外，還有研究表明是誘導甲殼動物肝胰腺卵黃蛋白原(vitollogenin,Vg)基因表達和促進卵巢早期階段的卵黃發生[11]。

有研究表明，根頭目蟹奴寄生于宿主后，其內體組織會入侵宿主的腹神經節并逐步分解神經內分泌細胞，導致YO萎縮或退化，從而抑制宿主的蛻皮行為[12-13]。為此，筆者以南海沿岸海域中華雙環粒蟹奴寄生最為嚴重的紅星梭子蟹(Portunussanguinolentus)為試驗對象，聚焦蟹奴寄生前后宿主不同蛻皮階段的EH含量及MIH、EcR表達量分析，了解蛻皮過程蛻皮激素含量變化及基因表達水平。該研究成果可初步掌握蟹奴寄生導致宿主蟹延緩蛻皮或“蛻皮未遂”的成因，為深入探討蟹奴病害的防控措施及提高我國在蟹奴領域的理論知識水平提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料來源2019年10月，從汕尾紅海灣海域底拖網漁船漁獲物中采集200尾野生紅星梭子蟹樣品，其中正常蟹100尾(對照組)，感染蟹100尾(試驗組，以腹部寄生有中華雙環粒蟹奴外體為判斷依據，圖1)，雌雄比例為1∶1。根據梭子蟹類蛻皮特征，收集處于蛻皮間期的樣品，對照組健康無殘肢，試驗組無蟹奴以外的其他病害。樣品蟹規格盡量保持均一，正常蟹甲寬為(62.7±6.0) mm，體重為(13.5±3.5) g；感染蟹甲寬為(63.1±5.5) mm，體重為(13.7±3.0) g。將試驗蟹分別置于200個容積為24 L的吊籃中進行飼養，吊籃懸掛于2個4 m×4 m×2 m的循環水養殖池內，每天傍晚投喂鮮活縊蟶1次，并定時清除籃內殘渣。

圖1 受中華雙環粒蟹奴寄生的雌性紅星梭子蟹Fig.1 Female Portunus sanguinolentus parasitized by Diplothylacus sinensis

每天觀察感染蟹的存活和蛻皮情況，參照沈潔等[14]對梭子蟹類的蛻皮分期劃分方法，將蛻皮周期分為4個時期：蛻皮間期、蛻皮前期、蛻皮期和蛻皮后期。該試驗養殖和取樣周期耗時42 d，最終試驗組成活47尾(蛻皮40尾，7尾蛻皮不遂)，對照組成活60尾(均正常蛻皮)。

1.2 試驗方法

1.2.1血清樣本制備及蛻皮激素測定。記錄試驗組和對照組每個體蛻皮間期所耗時間，抽取蛻皮間期、蛻皮前期、蛻皮期和蛻皮后期的試驗蟹血淋巴樣品。各蛻皮期雌蟹和雄蟹均取5個樣品作為生物學重復，采用注射器從第3步足抽取300 μL血淋巴用于血清樣品制備。室溫自然凝固15 min，然后2 500 r/min離心20 min，收集上清置于-20 ℃保存。各期試驗樣品的蛻皮激素含量測定參照蟹蛻皮甾體(ecdysteriod)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)使用說明書。

1.2.2總RNA提取及基因表達分析。按照“1.2.1”試驗樣品分組，取各期紅星梭子蟹眼柄和血淋巴組織置于液氮中保存。將樣品轉移至裝有300 μL Trizol (上海生工)的1.5 mL離心管中，按照Trizol試劑盒(上海生工)說明對樣品總RNA進行提取。為保證總RNA純度，采用DNase I (Takara)去除基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，最后使用超微量分光光度計Nanodrop 2000C (Thermo Fisher)進行純度檢驗。取1.0 μg RNA樣品，采用PrimeScript RT-reagent Kit試劑盒(Takara)對眼柄和血淋巴總RNA進行反轉錄以獲得模板cDNA。

根據課題組前期已獲得的MIH和EcR基因序列，利用Primer Premier Version 6軟件進行熒光(qPCR) 定量引物設計(表1)，并選取β-actin基因作為內參基因。分別選取眼柄和血淋巴組織的cDNA作為模板，利用Qiagen熒光定量PCR儀器(Qiagen,德國)對目的基因進行序列擴增。qRT-PCR反應條件：95 ℃ 預變性5 min，95 ℃ 變性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共44個循環。循環結束后，從60 ℃開始每5 s溫度上升0.5 ℃直至95 ℃，以連續測定樣品的熒光強度獲得溶解曲線。采用2-ΔΔCt方法計算目的基因表達量，不同蛻皮階段的基因表達量則以蛻皮后期樣品中的Ct表達值作為參照，其表達水平以倍數表示[15]。

1.3 數據處理與分析采用SPSS 19.0軟件對試驗測得的EH含量、MIH和EcR基因的相對表達量等數據進行統計分析，相關圖件使用Excel 2010、OriginPro v9.8.0等軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 蛻皮間期持續時間對感染蟹和正常蟹的蛻皮間期持續時間統計結果表明，感染蟹蛻皮所耗時間相對正常蟹較長，雄性感染蟹(n=14)、雄性正常蟹(n=23)、雌性感染蟹(n=26)和雌性正常蟹(n=37)蛻皮間期時間分別為(291.5±115.5)、(193.5±35.4)、(342.1±144.5)和(231.1±84.0) h (圖2)。單因素方差分析(One-way ANOVA)結果表明，中華雙環粒蟹奴寄生對雌性紅星梭子蟹蛻皮間期持續時間影響顯著(P<0.05)。另外，試驗組和對照組的雌、雄蟹之間蛻皮間期持續時間差異均不明顯。

2.2 蛻皮激素含量變化圖3所示為不同蛻皮階段的紅星梭子蟹蛻皮激素含量受中華雙環粒蟹奴寄生的影響變化。對照組和試驗組血淋巴檢測結果均顯示，受感染前后各期紅星梭子蟹EH含量均表現出顯著差異(P<0.05)，蛻皮間期含量最低，蛻皮前期含量達到峰值，隨著蛻皮的進行EH含量逐漸下降。感染蟹與正常蟹比較，雌性和雄性感染蟹EH含量在蛻皮間期和前期水平均顯著低于正常蟹(P<0.05)，表明中華雙環粒蟹奴的寄生與宿主蟹的蛻皮激素分泌水平相關。此外，2種性別紅星梭子蟹EH含量未見顯著差異(P>0.05)。

表1 MIH、EcR和β-actin基因qRT-PCR引物Table 1 The primer sequences for real-time quantitative PCR of MIH,EcR and β-actin gene

圖2 正常蟹與受中華雙環粒蟹奴感染的紅星梭子蟹蛻皮間期持續時間Fig.2 Duration of intermolt period of normal and D.sinensis-infected P.sanguinolentus

圖3 中華雙環粒蟹奴寄生對不同蛻皮階段紅星梭子蟹EH含量的影響Fig.3 Effect of the parasitism of D.sinensis on EH content of P.sanguinolentus at different molting stages

2.3 蛻皮相關基因表達量變化從圖4a可看出，各組感染蟹的蛻皮間期MIH表達量均顯著高于其余3個時期(P<0.05)，其中以雌性感染蟹蛻皮間期MIH相對表達量最高(4.03±0.26,n=5)。蛻皮前期，各組樣品MIH含量均迅速下降至谷值，而后隨著蛻皮時間的推移逐漸升高。單因素方差分析結果顯示，受中華雙環粒蟹奴寄生的紅星梭子蟹總體MIH表達量與正常蟹之間無顯著差異(P>0.05)，但分期比較發現，雌雄感染蟹蛻皮間期的MIH表達量均顯著高于正常蟹(P<0.05)，表明該時期是中華雙環粒蟹奴抑制宿主蛻皮的關鍵階段。

熒光定量分析結果顯示，各組紅星梭子蟹不同蛻皮階段的EcR基因相對表達量變化與MIH基因呈相反趨勢(圖4b)，即蛻皮間期表達量最低，蛻皮前期增加至最高水平，而后逐漸下降。整體而言，中華雙環粒蟹奴寄生對紅星梭子蟹EcR基因表達量的影響不顯著(P>0.05)。各階段單因素方差分析結果表明，雄性和雌性正常蟹的EcR基因表達量在蛻殼間期均高于感染組，呈極顯著差異(P<0.01)，而在其他蛻殼時期則未出現顯著差異。

2.4 蛻皮激素與蛻皮基因表達相關性分析將紅星梭子蟹各蛻皮時期的EH含量與MIH、EcR相對表達量進行兩兩對比分析，所得Pearson相關系數見表2。表2顯示，感染蟹各蛻皮時期的EH含量與同期的MIH相對表達量均呈負相關關系，除蛻皮前期外，其余3個時期均呈顯著或極顯著相關(P<0.05，P<0.01)，而不同時期二者含量無顯著相關(P>0.05)。各期感染蟹EH含量與EcR相對表達量比較，結果均表現顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)正相關關系，不同時期無顯著相關性。由此可見，紅星梭子蟹血淋巴中蛻皮激素含量與EcR相對表達量呈協同作用關系，與MIH相對表達量則呈拮抗關系。另外，Mantel Test相關性分析結果表明，中華雙環粒蟹奴對紅星梭子蟹蛻皮相關激素和基因表達的影響主要作用于蛻皮間期和蛻皮前期(圖5)。

圖4 中華雙環粒蟹奴寄生對紅星梭子蟹蛻皮相關基因MIH和EcR相對表達量的影響Fig.4 Effect of the parasitism of D.sinensis on relative expression of MIH and EcR of P.sanguinolentus at different molting stages

表2 各期紅星梭子蟹EH含量與MIH、EcR相對表達量相關性

注：IMP.蛻皮間期;PRMP.蛻皮前期;MP.蛻皮期;POMP.蛻皮后期 Note:IMP.Intermolt period;PRMP.Premolt period;MP.Molting period;POMP.Postmolt period圖5 受感染紅星梭子蟹蛻皮激素與相關基因表達量相關性Fig.5 Mantel test analyses between EH content and molting-related gene expression of P.sanguinolentus

3 討論

蛻皮是甲殼類動物生長發育必經的重要過程，該過程所需的蛻皮激素由Y-器官分泌，其分泌量的多寡與蛻皮階段有關，一般而言呈規律性變化，蛻皮前期分泌量達到高峰期[16]。該研究中各蛻皮階段EH含量變化趨勢與前人研究結果一致[17-18]，表現為蛻皮間期含量最低，蛻皮前期上升至最高值，隨后逐漸下降。蛻皮間期是甲殼動物攝食和營養物質儲備最活躍的時期，也是蛻皮周期中最穩定且持續時間最長的階段，而在蛻皮前期則需通過自身調控分泌大量的蛻皮激素促進表皮回縮，以保證蛻皮活動的順利進行[19]。

蟹奴是自然海域和養殖水域常見的蟹類寄生蟲，一般于宿主蛻皮期進行入侵，寄生后的內體部分(又稱“營養系統”)留存于宿主體內吸取營養，從內體延伸至宿主體外的部分為外體(又稱“生殖系統”)[2]。在一些寄生情形下，蟹奴外體的出現將阻止宿主蟹蛻皮行為的發生[20-21]。有學者推測，根頭目寄生蟲可能干擾宿主Y-器官中EH前體的合成或刺激X器官-竇腺復合體分泌MIH，以達到抑制宿主蛻皮、保障自身完成寄生周期的目的[22]。據研究表明，受蟹奴寄生的哈氏泥蟹(Rhithropanopeusharrisii)不僅蛻皮行為受阻，周期明顯延長，其斷指再生能力也同樣受到抑制[23]，而在摘除蟹奴外體后，宿主的蛻皮能力可再次得到恢復[24]。另外，一些蟹奴類群(如Chthamalophilidae科和Peltogastridae科)的寄生不會明顯阻礙宿主的正常蛻皮，在外體伴隨宿主蛻皮而脫落后，其基部表皮仍會粘連于宿主新生表皮，以便繼續完成自身寄生生活史[25]。

EcR基因是促進甲殼動物蛻皮和外骨骼生長的關鍵基因，與MIH基因共同調控甲殼類的蛻皮行為[7]。該研究結果表明，無論是受蟹奴感染的宿主蟹，還是正常蟹，其不同蛻皮階段的EcR基因和MIH基因相對表達量均呈現相反的趨勢，即EcR基因在蛻皮前期表達量最高，蛻皮間期最低，而MIH基因在蛻皮間期含量最高，蛻皮前期最低，這與傳統的甲殼類蛻皮相關基因表達研究結果相符[6,11,19]。同時，各期紅星梭子蟹EcR基因相對表達量與EH含量呈正相關關系，二者之間呈協同作用關系，且在蛻皮前期最為顯著；蛻皮期的EH含量急劇下降，可能是由于當EcR表達量高于臨界值時，反而會致使Y-器官EH的合成受到抑制。這與黃姝等[26]對于中華絨螯蟹蛻殼基因表達的研究結果一致，高表達量的EcR基因對蛻皮激素的合成起到負反饋調控作用。

感染蟹與正常蟹比較，僅發現中華雙環粒蟹奴對蛻皮間期紅星梭子蟹血淋巴中EcR基因和MIH基因相對表達量影響顯著，表明該時期是蟹奴干擾宿主生理行為的關鍵階段。前人有關蟹奴寄生對宿主蛻皮抑制相關機理的報道較少，有研究指出受蟹奴感染的方形大額蟹(Metapograpsusthukuhar)血淋巴高血糖激素含量未受影響，且其X器官-竇腺復合體形態仍保持完整[27]，但可抑制阿拉斯加帝王蟹(Paralithodescamtschaticus)血淋巴滲透壓的正常調節，促進血藍蛋白和葡萄糖的合成，加速代謝并為蟹奴生長和繁殖提供所需能量[28]。此外，Hsiao 等[27，29]研究發現，扁平蟹奴(Polyascusplana)寄生可降低宿主血淋巴中乙酰膽堿和甘油三酯的水平，推測蟹奴可能通過分泌某種化學物質干擾宿主正常的能量代謝，致使一些受寄生的宿主類群體型偏小，并產生“性逆轉”現象。

甲殼動物蛻皮是一個極其復雜的過程，除受自身內在因素影響外，還受外界溫度、光照、鹽度等諸多因素影響[30]。蟹奴種類繁多，不同類群形態各異，其入侵宿主的途徑、繁殖方式和生活史也不盡相同，對宿主的危害程度也有所差別[31]。目前大多數研究集中于寄生后宿主的形態、行為以及生理等方面的影響，因此，今后有必要針對蟹奴的寄生機理及其影響宿主蛻皮和代謝關鍵信號通路等方面展開進一步研究。

4 結論

紅星梭子蟹的蛻皮行為與其EH含量變化密切相關，中華雙環粒蟹奴寄生可在一定程度上干擾宿主蛻皮相關激素分泌和基因表達，從而抑制或延緩其蛻皮行為。