香港牡蠣鈣調蛋白基因的克隆和組織表達分析

李素萍，喻達輝，李應清，王 培，郭 穎，白麗蓉

(北部灣大學海洋學院，廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室，廣西欽州 535011)

雙殼類動物的貝殼都是鈣代謝產物，含有90%以上的CaCO3晶體和百分之幾的生物大分子基質[1]。近10年，人們為闡明殼的形成機制作出了許多努力，已從雙殼貝類中鑒定出10余種基質蛋白[2-5]。然而，以往對貝殼形成的分子機制研究集中于基質蛋白的純化和表征上，而忽略了貝類鈣代謝的機制。鈣離子不僅是參與雙殼類動物許多生理過程的調節劑，而且是參與殼結構形成的主要陽離子，在貝殼的形成過程中，需要大量的鈣離子不斷沉積在基質蛋白形成的骨架上[6]。Ca2+攝取、積累、轉運、摻入的機制以及這些過程中涉及的特定調節劑仍然是一個有吸引力的領域，有待進一步研究。

鈣調蛋白(Calmodulin，CaM)是一種主要的細胞內鈣受體，存在于許多不同的細胞類型中，是動物中最保守的蛋白質之一。CaM以鈣離子(Ca2+)依賴性方式結合并調節蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶。它參與一系列細胞過程，包括分泌、細胞分裂和分化、DNA復制和修復、肌肉收縮和糖原代謝、滲透細胞體積調節和細胞內通訊[7]。在高等脊椎動物中，CaM由多種基因編碼，如人和小鼠的CaM I、II和III，雞的CaM I和II[8-9]。在雙殼類生物中，鈣調蛋白可以調節Ca2+-ATPase膜系統來捕獲環境中的Ca2+，細胞外CaM或CaM樣蛋白(CaMLP)和CaM或CaMLP結合蛋白被認為在生物礦化中起重要作用[10-11]。CaM基因在外套膜裙帶及外套膜外表皮上高表達，外套膜主要參與貝殼形成過程中Ca2+的分泌，因此，雙殼類動物體內的CaM不僅是參與許多生理過程的調控，而且是貝殼結構形成的主要調控因素[12]。

香港牡蠣(Crassostreahongkongensis)分布于我國南部沿海，是兩廣地區最常見、最主要的牡蠣養殖種類之一，具有較高的營養價值和經濟價值[13-15]。但香港牡蠣生長速度緩慢，養殖周期長，沿海地區臺風頻繁，牡蠣養殖深受其害，常常造成巨大經濟損失，故在香港牡蠣的養殖產業中，一直存在著提高生長速度、縮短養殖周期的強烈需求[16]。香港牡蠣的生長與貝殼形成密切相關，為提高香港牡蠣生長速度、縮短養殖周期，加快貝殼的形成，探究貝殼形成的分子礦化機制是重中之重[17-19]。目前，CaM作為生物體內重要的調控蛋白，是貝殼形成的主要調控因素，因此以香港牡蠣為研究對象，對香港牡蠣貝殼形成的分子礦化機制進行研究。

筆者采用RACE技術克隆了香港牡蠣CaM基因cDNA全長序列，并分析其核酸和氨基酸序列，預測CaM二級結構和三級結構，并采用實時熒光定量PCR技術檢測香港牡蠣CaM基因在不同組織中的表達情況，對香港牡蠣CaM基因的功能進行深入研究，旨在為研究香港牡蠣貝殼形成機制及CaM基因蛋白功能研究提供分子理論基礎，為生產實踐提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料香港牡蠣采集于廣西欽州市東風市場，取其新鮮的外套膜、鰓、閉殼肌、性腺、心臟、血淋巴、觸唇和消化腺8個組織立即放入液氮速凍，置-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2 總RNA提取與cDNA的合成取香港牡蠣的閉殼肌、外套膜、鰓、血液、性腺、心臟、觸唇和消化腺8個組織用研磨儀研磨，參照TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒(全式金)提取總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的完整性并用Little Lunatic(USA)測定其濃度，用TransScript II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒(全式金)合成模板cDNA，置-20 ℃保存備用。

1.3 RACE獲得香港牡蠣CaM基因cDNA全長根據GenBank中已知的太平洋牡蠣(Crassostreagigas)CaM基因cDNA全長序列，設計特異性引物CaM-F和CaM-R，擴增出目的片段，反應程序為94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，運行35個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR產物用DNA膠回收試劑盒(TIANGEN)純化，參照pEASY?-T1 Cloning Kit(全式金)說明書進行連接轉化，陽性克隆送生工生物工程(上海)有限公司測序，測序結果與長牡蠣CaM基因cDNA序列比對，相似性極高。

根據測序出的目的片段設計5′RACE和3′RACE擴增的基因特異性引物，參照5′RACE試劑盒(北京百奧博萊科技)說明進行上游未知片段擴增，利用引物5′RACE-A將模板RNA進行逆轉錄成cDNA，模板cDNA經加帽反應使用引物5′RACE-B進行第1輪反應，反應程序為：94 ℃變性5 min；50 ℃退火2 min，72 ℃延伸4 min，進行1個循環；94 ℃變性40 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，進行29個循環；72 ℃終延伸15 min。以稀釋20倍的第1輪PCR產物為模板，用引物5′RACE-C進行第2輪反應，反應程序為：94 ℃變性40 s；55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，進行30個循環；72 ℃終延伸15 min。

參照3′RACE試劑盒(北京百奧博萊科技)說明進行下游未知片段擴增，使用引物3′RACE-A進行第1輪反應，反應條件為：55 ℃ 2 min，72 ℃ 40 min，1個循環；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，30個循環；72 ℃ 15 min。以稀釋20倍的第1輪PCR產物為模板，引物3′RACE-B進行第2輪反應，反應程序為：94 ℃ 40 s；55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，30個循環；72 ℃終延伸15 min。將2輪反應之后的5′RACE和3′RACE PCR產物分別進行膠回收后進行連接轉化，陽性克隆送生工生物工程(上海)有限公司測序。引物序列見表1。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Sequences of primers in this study

1.4 生物信息學分析利用NCBI數據庫中的Blast(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、ORFfinder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)和ChromasPro.2.1.3等軟件對測序結果進行驗證分析并拼接出全長cDNA序列。使用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)預測該蛋白的基本理化性質；使用Soft Berry-Psite(http：//linux1.softberry.com/berry.phtml)預測蛋白功能位點；使用Signa1P 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/Sig-nalP)預測信號肽序列；使用TMpred(http：//www.cbs.dtudk/services/TMHMM)預測跨膜結構域；使用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)預測該蛋白質結構域；使用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)分別預測該蛋白質的二級和三級結構；使用PSORTⅡPrediction軟件(https：//psort.hgc.jp/form2.html)進行亞細胞定位分析；使用Clustalx1.81軟件進行多重序列比對；使用MEGA 7.0軟件的鄰接法(neighbor-joining，NJ)構建系統發育進化樹，進化距離的計算采用Kimura雙參數模式。

1.5 熒光定量PCR分析以香港牡蠣8個組織的cDNA為模板，根據全長序列設計定量引物qRTCaM-F和qRTCaM-R，以GAPDH為內參基因，每個樣品進行3次重復。參照TransStart? Tip Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒(全式金)進行qRT-PCR，反應程序為：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 s。數據由Roche LightCycler 96軟件生成并記錄，按照2-ΔΔCt計算組織表達水平，采用SPSS 22軟件進行單因素方差分析法(one-way ANOVA)，Tukey檢驗，P<0.05表示顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 香港牡蠣CaM基因cDNA全長序列以香港牡蠣的cDNA為模板，使用RACE試劑盒獲得香港牡蠣鈣調蛋白ChCaM基因序列全長cDNA(Gen Bank登錄號為：MZ192519)，其全長為770 bp，開放閱讀框(Open reading frame，ORF)為450 bp，5′非編碼區(5′-UTR)54 bp及3′非編碼區(3′-UTR)266 bp，香港牡蠣CaM基因編碼149個氨基酸。通過SMART在線分析軟件預測香港牡蠣CaM含有4個EF-hand結構域，分別位于12～40、48～76、85～113、121～149位氨基酸(圖1)。針對香港牡蠣CaM蛋白質進行理化性質分析，發現氨基酸理論分子量為16.82 kD，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)有15個，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)有38個，理論等電點為4.14。該蛋白脂溶指數(Aliphatic index)為64.83，親水性(GRAVY)總平均值為-0.656，半衰期約為30 h，不穩定指數為31.08，因此該蛋白是一類穩定的親水性蛋白質。Soft Berry-Psite預測該蛋白功能位點，發現香港牡蠣CaM具有2個N-肉豆蔻?；稽c，7個酪蛋白激酶II磷酸化位點，2個蛋白激酶C磷酸化位點和1個N-糖基化位點(圖2)。使用SignalP 4.1 Server程序未能預測到信號肽信號；使用TMpred軟件未發現跨膜結構，不屬于跨膜蛋白；利用PSORTⅡPrediction軟件對香港牡蠣CaM蛋白進行亞細胞定位分析發現該蛋白在細胞質中分布最多，占52.2%，在分泌系統小泡中分布最少，為4.3%，細胞核和線粒體中分別為30.4%和13.0%。

注：方框表示起始密碼子和終止密碼子，綠色陰影部分為鈣調蛋白結構域，黃色陰影部分為AATAAA加尾信號 Note：The boxes represent the start and stop codons，the green area represents the calmodulin domain，and the yellow area represents the AATAAA tail addition signal圖1 香港牡蠣CaM基因的核酸序列和氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence from ChCaM gene

圖2 香港牡蠣CaM的功能位點預測Fig.2 Prediction of functional site of ChCaM

2.2 香港牡蠣CaM結構預測使用SOPMA工具對香港牡蠣CaM蛋白的二級結構進行預測，結果顯示，CaM預測蛋白包含59.73% α螺旋(alpha helix)、6.04%延伸鏈(extended strand)、9.40% β轉角(beta turn)和24.83%不規則卷曲(random coil)(圖3)。通過SWISS-MODEL對香港牡蠣和人的CaM基因編碼的蛋白進行三級結構模擬，模擬發現二者蛋白三級結構相似性極高(圖4)。

注：藍色.α螺旋;紅色.延伸鏈;綠色.β轉角;粉紅.不規則卷曲 Note：Blue.Alpha helix;Red.Extended strand;Green.Beta turn;Pink.Random coil圖3 香港牡蠣CaM蛋白質二級結構預測Fig.3 Predicted two-dimensional structure of ChCaM

注：a.香港牡蠣；b.人；c.疊加 Note：a.Crassostrea hongkongensis;b.Homo sapiens;c.Overlay圖4 CaM蛋白質三級結構預測Fig.4 Predicted three-dimensional structure of CaM

2.3 香港牡蠣CaM氨基酸序列同源性從NCBI下載11個其他物種CaM氨基酸序列(表2)，經DNAstar軟件對香港牡蠣與其他物種的CaM進行氨基酸序列同源性分析(圖5)，結果發現香港牡蠣和長牡蠣的CaM同源性最高，相似度高達100%，美洲牡蠣次之，達到98.7%，其他物種的相似度為93%～97%。運用DNAMAN軟件將香港牡蠣CaM的氨基酸序列與其他已公布的8種生物進行多重序列比對分析(圖6)，結果顯示，香港牡蠣CaM氨基酸序列與長牡蠣和美洲牡蠣有較高的相似性，而與魚類、甲殼類和哺乳動物序列相似性相對較低；CaM氨基酸排序呈現很高的相似性和高度保守性。結果表明，CaM的氨基酸序列具有典型的鈣調蛋白特征(EF-hand結構域)，發現以上9個物種均有4個EF-hand結構域(I、II、III和IV)，且它們表現出彼此的序列同源性。每個結構域由12個氨基酸殘基組成，其中6個作為金屬-蛋白質復合物中Ca2+的配體[如天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)]。CaM基因所編碼的氨基酸序列高度保守，尤其表現在EF-hand結構域Ca2+結合位點上，暗示CaM基因在機體中有極其重要的功能和作用。

2.4ChCaM基因系統進化樹為比較不同物種CaM基因序列的親緣關系，從NCBI數據庫中查找其他物種CaM基因cDNA序列，用MEGA 7.0軟件構建ChCaM與其他物種的系統進化樹(圖7)，結果顯示，香港牡蠣CaM與長牡蠣的遺傳距離最近，并與美洲牡蠣、蝦夷扇貝和池蝶蚌等雙殼類動物聚為一大支，具有較高的同源性，而與文昌魚和虹鱒等魚類、人和小鼠等哺乳動物以及中華絨螯蟹和克氏原螯蝦等甲殼類動物分支較長，距離較遠，同源性較低。

2.5 香港牡蠣CaM基因的組織特性表達使用SPSS 22.0軟件進行單因素分析，通過實時定量PCR的方法檢測香港牡蠣CaM mRNA在各個組織中的表達量，結果表明，CaM基因在香港牡蠣各個組織中均有表達，其中鰓組織的表達量最高，其次為外套膜、消化腺、觸唇、血淋巴、性腺、閉殼肌，在心臟的表達量最低(圖8)。

圖5 香港牡蠣CaM氨基酸與其他11個物種的同源百分比Fig.5 Percent identity of CaM amino acids of Crassostrea hongkongensis and other 11 species

表2 同源百分比與序列比對所用物種Table 2 Species used in alignment and percent identity

3 討論

3.1 香港牡蠣CaM基因cDNA序列特征和系統進化鈣調蛋白是貝類中重要的調控蛋白，是鈣離子結合蛋白家族成員，能夠結合微量鈣離子，對真核細胞內的酶起到激活作用，調節細胞的生命活動，進而調控Ca2+的吸收、轉運和分泌[20-21]。該研究利用RACE技術克隆獲得香港牡蠣CaM基因的cDNA序列，全長為770 bp，編碼149個氨基酸。生物信息學分析香港牡蠣CaM蛋白具有4個典型的EF-hand結構域，能夠與鈣離子結合，屬于典型的鈣離子結合蛋白家族成員，這與已有研究報道的合浦珠母貝體內的鈣調蛋白的結構域相似[10]。鈣調蛋白是一種由148個氨基酸殘基組成的蛋白質，可形成2個球狀區域，由1個靈活的中心連接器連接[22]。

注：顏色表示氨基酸序列相似度(黑色.100%；粉色.70%；綠色.50%及以上；白色.50%以下)，上方綠色箭頭表示4個EF-hand結構域，紅色方框為EF-hand鈣結合域 Note：The color indicates the similarity of amino acid sequence(black.100%;Pink.70%;Green.≥50% and <70%;White.<50%).Green arrow indicates 4 EF-hand domains above，the red box is EF-hand calcium-binding domain圖6 香港牡蠣CaM氨基酸序列與其他物種CaM的序列比對Fig.6 Alignment CaM amino acid of Crassostrea hongkongensis and other species

注：括號中為GenBank登錄號 Note：The GenBank entry number is given in parentheses圖7 CaM核酸序列構建的系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of CaM from various species

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Note：Different lowercase letters indicate significantly different (P<0.05)圖8 CaM基因在香港牡蠣不同組織的表達情況Fig.8 Expression pattern of CaM gene in different tissues of Crassostrea hongkongensis

每個區域結合EF-hand基序中的2個鈣離子，這是鈣結合蛋白中普遍存在的一個基序，因此鈣調蛋白可以結合4個鈣離子，與哺乳動物人和軟體動物香港牡蠣的三級結構預測結果一致。鈣結合位點為12個氨基酸，包含許多負電荷或極性氨基酸殘基，如天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺，這些氨基酸的側鏈與Ca2+形成離子鍵。CaM含有豐富氧原子側鏈的氨基酸殘基，即使在Ca2+濃度很低的環境中也能吸引鈣離子促進Ca2+與氨基酸結合。氨基酸的功能位點預測發現，其4個EF-hand結構域上有1個N-糖基化位點，2個蛋白激酶C磷酸化位點，3個酪氨酸激酶磷酸化位點等，表明其在細胞與細胞間結合和信號傳導過程中起著重要作用。

鈣調蛋白是一種必需的蛋白質，也是一種穩定的蛋白質，任何一種鈣調蛋白編碼基因的突變或者鈣調蛋白結合位點的損傷通常都是致命的[7]。來自不同脊椎動物物種的CaM基因編碼具有相同氨基酸序列的相同CaM分子，表明其在脊椎動物進化過程中高度保守[23]。此外，2個不同的無脊椎動物?？?Metridiumsenile)和池蝶蚌(Hyriopsisschlegeli)也編碼相同的CaM蛋白，表明CaM蛋白在無脊椎動物進化過程中也高度保守[23-24]。通過多序列比對，發現香港牡蠣CaM基因與長牡蠣CaM基因的同源性最高，核酸序列同源性為97.11%，氨基酸序列同源性高達100%，說明CaM蛋白在雙殼類動物進化過程中高度保守，進一步反映了這種蛋白質在細胞正常功能中的重要性。比較香港牡蠣CaM基因核酸序列EF-hand結構域之間的同源性，發現EFh1和EFh3與EFh2和EFh4核酸序列具有高度同源性，均為57.5%，表明參與鈣離子結合的部分分子比其他部位更保守[10]。構建系統發育樹發現，香港牡蠣CaM基因和長牡蠣CaM基因位于同一分支，說明香港牡蠣和長牡蠣的親緣關系較近，與其他物種的親緣關系較遠，這與他們的生物學分類相符。由此推測，CaM保守結構域在進化過程中具有較高的保守性，并且不同物種有不同的差異性。

3.2 香港牡蠣CaM基因的組織表達分析貝殼形成是一個復雜、精密調控的生物礦化過程，自然條件下構成貝殼的碳酸鈣晶體并不是在單一組織作用下形成的，而是多個組織共同作用的結果[25-26]。熒光定量檢測發現，CaM基因在香港牡蠣鰓組織中表達量最高，是心臟組織表達量的(198.57±4.00)倍，與合浦珠母貝和池蝶蚌CaM基因組織表達趨勢相同[24]。在雙殼類動物中，鰓是從水中吸收鈣的主要器官，在膜Ca2+-ATP酶系統中發揮調節作用[27-28]。香港牡蠣CaM在鰓組織中高表達，說明CaM在香港牡蠣鰓吸收和積累鈣的過程中具有重要的調控作用。在軟體動物中，外套膜與貝殼直接接觸的區域能夠分泌角質層和鈣化層[29]，是殼的形成過程中的關鍵調控因子。筆者發現CaM基因在香港牡蠣外套膜組織中表達量是心臟組織的表達量的(183.64±7.18)倍，這與其他動物的報道相似。這暗示了香港牡蠣CaM基因通過鰓和外套膜組織共同參與調控Ca2+的吸收、轉運和分泌等鈣代謝途徑。由此推測香港牡蠣貝殼的形成是由鰓從外界環境中吸收Ca2+并轉運到外套膜中，并通過鈣泵將離子從外套膜運輸到外套腔分泌中形成貝殼。因此，在貝類貝殼形成的生物礦化過程中，鈣調蛋白被認為有極其重要的作用。

4 結論

該研究克隆了香港牡蠣CaM基因cDNA序列，全長為770 bp，編碼149個氨基酸，具有4個EF-hand結構域。通過多序列比對及構建系統發育樹發現，香港牡蠣CaM基因與長牡蠣CaM基因的同源性最高(97.11%)，并且位于同一分支。熒光定量檢測發現，CaM基因在香港牡蠣各組織中都有表達，其中鰓組織的表達量最高，其次為外套膜、消化腺、觸唇、血淋巴、性腺、閉殼肌，心臟的表達量最低。該研究結果將有望為香港牡蠣貝殼形成的生物礦化機制及CaM基因功能研究提供基礎資料。