紫斑牡丹花粉破壁工藝優(yōu)化及其金屬元素測(cè)定

王新娣，石曉峰*，李 運(yùn)，沈 薇，劉東彥，范 彬，馬趣環(huán)

(1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅蘭州 730050；2.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，甘肅蘭州 730030)

紫斑牡丹(Paeoniarockii)是毛茛科芍藥屬多年生木本植物，因花瓣基部有一個(gè)明顯的紫斑而得名[1]，其主要分布于四川北部、甘肅南部、陜西秦嶺中段以西，是我國(guó)中西部地區(qū)的特有中藥材和花中珍品[2]。紫斑牡丹花粉中富含有多種營(yíng)養(yǎng)素、維生素和礦物質(zhì)，還含有大量天然活性物質(zhì)，如黃酮類(lèi)化合物、酶、激素、核酸和有機(jī)酸等[3]，由于花粉壁具有異常耐酸耐堿耐腐蝕的堅(jiān)硬外壁，阻礙了人體對(duì)花粉活性成分消化吸收，同時(shí)也阻止了花粉的高值化利用。因此，研究紫斑牡丹花粉破壁工藝對(duì)紫斑牡丹花粉綜合利用開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

目前花粉的破壁方法主要有生物法、化學(xué)法、物理法和復(fù)合法。曹紅剛等[4]用酵母、靈芝、杏鮑菇、羊肚菌4種真菌發(fā)酵油菜蜂花粉，其破壁率為 66.53%～79.10%。林瑾等[5]采用NaOH和H2O2預(yù)處理玫瑰蜂花粉，使其外壁破壞，再使用纖維素酶、黃瓜提取液和稀鹽酸溶液處理玫瑰蜂花粉，其破壁率達(dá)到99%。余勃[6]應(yīng)用微粉碎對(duì)茶花粉進(jìn)行破壁處理，花粉破壁率達(dá)100%。何余堂等[7]采用溫差法、超聲波法、酶法和混合法4種方法對(duì)玉米花粉進(jìn)行破壁處理，其破壁率分別為超聲波法31.2%、溫差法46.3%、酶法80.4%、混合法98.6%。上述諸多花粉破壁的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，有的方法設(shè)備成本投資較大，花粉破壁率高；有的方法成本低，花粉破壁率也低；有的方法引入其他化學(xué)溶劑，使樣品污染的可能性增大；有些方法處理周期長(zhǎng)，導(dǎo)致花粉容易變質(zhì)。在諸多的花粉破壁方法中，究竟哪一種更適合紫斑牡丹花粉，且營(yíng)養(yǎng)成分損失小，破壁率高，還需要進(jìn)行更多的試驗(yàn)驗(yàn)證。因此，該研究選投資成本低的溫差破壁法，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化牡丹花粉溫差破壁工藝，以破壁率為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)紫斑牡丹花粉進(jìn)行破壁，并測(cè)定和分析牡丹花粉中金屬含量變化，為紫斑牡丹花粉的綜合利用和開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑紫斑牡丹花粉，蘭州新區(qū)中川牡丹園提供，儲(chǔ)存于冰箱-18 ℃；99.99%氬氣，上海通輝特種氣體有限公司；99.99% 氦氣，上海通輝特種氣體有限公司；Mn、Zn、Pb、Cr、Cd、As 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，美國(guó)安捷倫科技股份有限公司;濃硝酸，色譜純，德國(guó)默克化工技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備MDF-C2156VAN低溫冷凍存儲(chǔ)箱，日本三洋公司； BCD-237HF可變溫冰箱，青島Haier 集團(tuán)；DW-86L626超低溫保存箱，青島Haier 集團(tuán)；BH-2日本電子顯微鏡，OLYMPUS公司；AE260萬(wàn)分之一電子天平，瑞士Mettle Toledo 公司；PT-10 pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌浴，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Agilent 7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)安捷倫科技股份有限公司；UltraCLAVELV微波消解儀，意大利麥爾斯通有限公司；Milli-Q IQ7000超純水系統(tǒng)，密理博中國(guó)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1牡丹花粉的預(yù)處理。將牡丹花粉均勻鋪在白色瓷盤(pán)上面，厚度不超過(guò)0.5 cm，蓋上一塊白布，低溫烘干，直至花粉中水分降至5%以下，過(guò)7號(hào)篩除雜，得到精選的牡丹花粉。

1.3.2破壁率的測(cè)定。分別精密稱(chēng)取未經(jīng)破壁處理花粉和破壁后花粉適量，制成相同濃度的混懸液，吸取相同體積混懸液，制片，在400倍電子顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，以未破壁花粉為對(duì)照。每個(gè)樣品重復(fù)制片3張，每片5個(gè)視野，觀(guān)察視野內(nèi)的細(xì)胞破碎情況，求平均值。根據(jù)公式破壁率=(1-A/B)×100%計(jì)算破壁率，式中，A為視野中未破壁的細(xì)胞數(shù)；B為視野中細(xì)胞總數(shù)。

1.3.3溫差破壁法的工藝優(yōu)選。將精選的紫斑牡丹花粉按溫差破壁工藝流程(紫斑牡丹花粉—低溫冷凍—高溫解凍—離心收集—低溫干燥—破壁花粉)進(jìn)行操作，按“1.3.2”方法測(cè)定花粉破壁率，采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選其破壁工藝。

1.3.4單因素試驗(yàn)。以破壁率為指標(biāo)，采用控制變量法考察冷凍溫度、液料比、冷凍時(shí)間、解凍時(shí)間、解凍溫度對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響。

1.3.5響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。以單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，以液料比、解凍時(shí)間、解凍溫度為響應(yīng)變量，破壁率為響應(yīng)值，利用DesignExpert 8.0.6軟件進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化花粉破壁工藝，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3.6紫斑牡丹花粉中金屬元素的測(cè)定。

1.3.6.1供試品溶液的制備。 取花粉樣品于60 ℃干燥4 h，取約0.3 g，精密稱(chēng)定，置于微波消解罐中，加65%硝酸3.0 mL、超純水1.0 mL，按表2程序進(jìn)行消解。冷卻后取出消解管，將消化液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用少量超純水洗滌消解管3次，合并洗滌液至容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，作為供試品原液，備用[8-9]。同時(shí)同法制備空白對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 Element and levels of RSM test

表2 微波消解程序Table 2 Procedures of microwave digestion

1.3.6.2儀器條件。采用氦氣碰撞反應(yīng)池模式，用調(diào)諧液對(duì)儀器質(zhì)量軸、分辨率、靈敏度、雙電荷、氧化物進(jìn)行優(yōu)化。氬氣為載氣，氦氣為碰撞氣體，等離子體氣流速15.0 L/min，載氣流速1.17 L/min，霧化器為Barbinton，石英雙通道霧化室，射頻功率1 300 W，霧化室溫度2 ℃，碰撞模式為氦氣流量5.0 mL/min，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)數(shù)為30 r/min，采樣深度8.0 mm，測(cè)點(diǎn)數(shù)3，分析時(shí)間0.1 s，重復(fù)次數(shù)3，全定量分析模式。

1.3.6.3樣品的含量測(cè)定。紫斑牡丹花粉破壁前后10種金屬元素的測(cè)定按“1.3.6.1”和“1.3.6.2”方法，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算各元素的平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫斑牡丹花粉破壁前后的顯微特征觀(guān)察未破壁紫斑牡丹花粉和破壁紫斑牡丹花粉分別置400倍電子顯微鏡下觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)破壁前花粉絕大多數(shù)為單花粉，少數(shù)為復(fù)合花粉，均被一層完整的膜包裹；破壁的花粉其包裹的膜層完全破裂、內(nèi)容物散在(圖1)。

圖1 紫斑牡丹花粉破壁前(a)、后(b)的顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of Paeonia rockii pollen before (a) and after (b) wall-breaking

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1冷凍溫度對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱(chēng)取精選牡丹花粉適量，4份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中分別于-10、-20、-75、-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，搖勻，置50 ℃水浴中中速攪拌6 h，得到花粉混合溶液；然后在高速離心機(jī)中離心10 min，所獲固體物質(zhì)于15～25 ℃的條件下干燥，即得到破壁牡丹花粉成品，測(cè)定其破壁率，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，隨著冷凍溫度降低，破壁率在提高，當(dāng)冷凍溫度為-150 ℃時(shí)，破壁率達(dá)到了最高值，由此確定冷凍溫度為-150 ℃，亦即溫差為245 ℃。

圖2 冷凍溫度對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.2 Effect of freezing temperature on wall-broken rate of Paeonia rocki pollen

2.2.2液料比對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱(chēng)取精選牡丹花粉適量，6份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入不同液料比(5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)的95 ℃沸水，其他步驟同“2.2.1”方法操作，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著液料比的增加破壁率不斷增加，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)，破壁率達(dá)到最大，之后隨液料比增加破壁率下降，究其原因可能是水量的多少會(huì)影響攪拌的力度。由此將液料比定為15∶1～25∶1。

圖3 液料比對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.2.3冷凍時(shí)間對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱(chēng)取精選牡丹花粉適量，5份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍不同時(shí)間(12、24、48、72、96 h)，取出，迅速加入20∶1的95 ℃沸水，其他步驟同“2.2.1”方法操作，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，冷凍12～24 h時(shí)，破壁率有較為明顯的上升趨勢(shì)，冷凍超過(guò)24 h后對(duì)破壁率影響不大，考慮到時(shí)間和效率的問(wèn)題，將冷凍時(shí)間固定為24 h。

圖4 冷凍時(shí)間對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.4 Effect of freezing time on wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.2.4解凍時(shí)間對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱(chēng)取精選牡丹花粉適量，5份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，搖勻，置50 ℃水浴中中速攪拌，分別解凍2、4、6、8、10 h，其他步驟同“2.2.1”方法操作，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，破壁率隨著解凍時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)超過(guò)6 h時(shí)破壁率基本呈平緩趨勢(shì)，故將解凍時(shí)間固定為6 h左右。

圖5 解凍時(shí)間對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.5 Effect of defreeze time on the wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.2.5解凍溫度對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響。稱(chēng)取精選牡丹花粉適量，5份，分別裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，搖勻，分別置不同溫度(18、28、38、48、58 ℃)水浴中中速攪拌，分別解凍6 h，其他步驟同“2.2.1”方法操作，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，解凍時(shí)溫度在18～28 ℃，花粉的破壁率較大，當(dāng)溫度大于28 ℃時(shí)花粉破壁率呈明顯下降趨勢(shì)，而18～28 ℃基本是室溫水平，故從降低耗能的角度考慮，解凍溫度控制在18～28 ℃最佳。

圖6 解凍溫度對(duì)紫斑牡丹花粉破壁率的影響Fig.6 Effect of defreeze temperature on the wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果。由單因素試驗(yàn)篩選出的最佳溫差破壁工藝條件為冷凍溫度-150 ℃、冷凍時(shí)間24 h、液料比15∶1～25∶1、解凍時(shí)間6 h左右、解凍溫度18～28 ℃。固定冷凍溫度和冷凍時(shí)間，選擇影響溫差破壁工藝的因素液料比、解凍時(shí)間、解凍溫度，以花粉的破壁率(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)Box-benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，然后按表1設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

2.3.2模型的建立及顯著性檢驗(yàn)。利用 DesignExpert 8.0.6軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到花粉的破壁率(Y)對(duì)液料比(A)、解凍時(shí)間(B)、解凍溫度(C)的二元多項(xiàng)回歸模型為Y=-159.307 08+13.209 8A+41.111 863B-1.445 40C-0.099 5AB+0.013 3AC+0.076 6BC-0.331 03A2-2.915 81B2+3.067 5C2。通過(guò)對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析(表4)，可以看出模型的F=43.74(P< 0.000 1)，模型方程具有極顯著性；失擬項(xiàng)P=0.056 0，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不顯著；回歸決定系數(shù)(R2)為0.982 5，說(shuō)明 98.25%的響應(yīng)值變化來(lái)源于所選因素；修正回歸決定系數(shù)(Radi)為0.960 1，說(shuō)明該模型能解釋 96.01%的響應(yīng)值變化；預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值具有高度相關(guān)性，說(shuō)明該回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合度較好，試驗(yàn)結(jié)果可靠。由回歸方程和方差分析還可看出，一次項(xiàng)中B、C對(duì)破壁率具有極顯著影響，A對(duì)破壁率影響不顯著，交互項(xiàng)中AB、BC、AC對(duì)破壁率影響不顯著；二次項(xiàng)中A2、B2對(duì)破壁率有極顯著影響，而C2對(duì)破壁率影響不顯著，說(shuō)明所得回歸方程能夠很好地預(yù)測(cè)花粉破壁率隨各響應(yīng)因子的變化而變化。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variances

2.3.3響應(yīng)面分析。依回歸模型作出各因素對(duì)花粉破壁率影響的響應(yīng)面圖，考察響應(yīng)面的形狀，分析溫差破壁各因素對(duì)花粉破壁率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

交互作用的大小可由等高線(xiàn)的形狀來(lái)反映，若呈橢圓形，說(shuō)明兩因素的交互作用顯著，若呈圓形則相反，而響應(yīng)面曲線(xiàn)較陡也說(shuō)明兩因素交互作用顯著。由圖7可知，BC有一定的交互作用。

2.3.4最佳破壁工藝條件的確定和驗(yàn)證試驗(yàn)。通過(guò)DesignExpert 8.0.6軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行求解，得到牡丹花粉溫差破壁的最佳工藝條件:冷凍溫度-150 ℃、冷凍時(shí)間24 h、液料比19.27∶1、解凍時(shí)間6.96 h、解凍溫度20 ℃，其理論破壁率為93.11%。考慮到實(shí)際操作的簡(jiǎn)便性和可操作性，調(diào)整工藝條件為冷凍溫度-150 ℃、冷凍時(shí)間24 h、液料比20∶1、解凍時(shí)間7 h、解凍溫度20 ℃。在此最優(yōu)破壁條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到牡丹花粉的平均破壁率為 92.82%，與理論值間誤差較小，說(shuō)明利用響應(yīng)面優(yōu)化得到的條件準(zhǔn)確、可行。

2.4 紫斑牡丹花粉樣品中金屬元素測(cè)定取紫斑牡丹花粉按“1.3.6.1”方法制備供試品溶液, 依法測(cè)定，計(jì)算出供試品溶液質(zhì)量濃度，即得各元素的具體含量，結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可以看出，紫斑牡丹花粉中金屬元素 Zn、Mg、 K、 Ca、Mn、 Fe、 Sr含量較高，參考《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》及《中華人民共和國(guó)藥典》中對(duì)中藥材(飲片)中重金屬及砷鹽限量指標(biāo)(Pb≤5.0 mg/kg、Cd≤0.3 mg/kg、As≤2.0 mg/kg)，紫斑牡丹花粉中有毒金屬元素Pb、Cd、As含量低于檢出限。

3 討論與結(jié)論

花粉的細(xì)胞壁由內(nèi)壁和外壁組成，外壁主要成分是孢粉素，是一種高分子氧化聚合物，使得花粉外壁非常堅(jiān)硬，即使人體在消化過(guò)程中未能完全破壞外壁。花粉破壁不可避免地破壞了其營(yíng)養(yǎng)成分，特別是酶類(lèi)物質(zhì)，而且花粉破壁后不易保存[10]。紫斑牡丹花粉是否應(yīng)該破壁將在后續(xù)的試驗(yàn)中求證。

圖7 液料比、解凍時(shí)間、解凍溫度對(duì)花粉破壁率的等高線(xiàn)和響應(yīng)面Fig.7 Contour line and surface plot of liquid-solid ratio,defreeze time and defreeze temperature on the wall-broken rate of Paeonia rockii pollen

表5 紫斑牡丹花粉破壁前后10種金屬元素的含量比較(n=3)

該試驗(yàn)以牡丹花粉破壁率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)對(duì)影響溫差破壁的因素(冷凍溫度、冷凍時(shí)間、液料比、解凍時(shí)間、解凍溫度)進(jìn)行了遴選，在此基礎(chǔ)上通過(guò)固定冷凍溫度和冷凍時(shí)間，選擇影響溫差破壁工藝的因素(液料比、解凍時(shí)間、解凍溫度)，根據(jù)Box-benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化得到牡丹花粉溫差破壁的最佳工藝，即精選牡丹花粉裝入塑料容器中，加蓋密封，置于冷凍裝置中于-150 ℃冷凍24 h，取出，迅速加入20倍的95 ℃沸水，搖勻，置20 ℃水浴中中速攪拌7 h，得到花粉混合溶液；然后在高速離心機(jī)中離心10 min，所獲固體物質(zhì)于15～25 ℃的條件下干燥，即得到破壁牡丹花粉成品，經(jīng)驗(yàn)證該工藝的平均破壁率為 92.82%，說(shuō)明工藝合理可行。

該試驗(yàn)利用ICP-MS法對(duì)產(chǎn)自甘肅蘭州的紫斑牡丹花粉中10種元素進(jìn)行了定量分析，結(jié)果顯示，紫斑牡丹花粉中宏量元素K、Mg、Ca的含量分別為13 649.5、2 441.3、743.7 μg/g；其他微量金屬元素中含量較高的為Zn、Fe、Mn，其含量分別為114.29、73.34、66.79 μg/g；紫斑牡丹花粉中有毒金屬元素Pb、Cd、As含量低于檢出限，符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及藥典的要求。故紫斑牡丹花粉是一種無(wú)污染天然的保健食品。

通過(guò)對(duì)紫斑牡丹花粉破壁前后金屬元素的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)固體顆粒中的Mn、Zn、Sr、Fe、K、Mg、Ca等金屬元素的含量均有所下降，這可能是紫斑牡丹花粉破壁后有大量的金屬元素從細(xì)胞壁內(nèi)釋放出來(lái)，一部分溶解于溶液中，從而造成破壁后固體顆粒中金屬元素含量減少，破壁后有利于微量元素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放。